השגת תרחיפים של תאים מרקמת מוח איסכמית של עכבר

קח רקמות מוח של עכברים איסכמיים המכילים תאי מוח ותאי חיסון חודרים.

טוחנים את הרקמות על מסננת ושוטפים עם חיץ.

צנטריפוגה את המסנן והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה בתמיסת אנזימי עיכול והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה.

דגירה לאנזימי העיכול כדי לפרק את המטריצה החוץ-תאית, ולשחרר את התאים.

סנן את התרחיף ושטוף עם מאגר המכיל DNase כדי להסיר DNA מזהם.

לאחר מכן, שטפו עם מאגר נטול DNase.

צנטריפוגה את המסנן והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים במדיום שיפוע צפיפות. לאחר מכן, העבירו את התכולה לצינור טרי וערבבו. צנטריפוגה להפרדת הרכיבים לפי צפיפות.

הסר את הסופרנטנט המכיל מיאלין ופסולת.

השעו מחדש את הגלולה במאגר נטול DNase. העבירו אותו שוב לצינור חדש ולצנטריפוגה.

השליכו את ה-supernatant כדי להבטיח הסרה מספקת של מדיום שיפוע הצפיפות.

לבסוף, השעו מחדש את התאים במאגר להמשך ניתוח.

בעזרת קצה הבוכנה של מזרק של 5 מיליליטר, מועכים את חתיכות רקמת המוח דרך מסננת תאים של 100 מיקרון, שוטפים ברציפות את המסננת עם HBSS קר כקרח עם סידן ומגנזיום. לאחר מכן הניחו את הרקמות ההומוגניות על קרח.

לאחר שכל הדגימות עובדו, סובב את תרחיפי התאים. והשליכו בזהירות את הסופרנטנטים. השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר העיכול. לאחר מכן העבירו את מתלה התאים לצינור של 2 מיליליטר.

ולדגור על התאים בסיבוב איטי ומתמשך ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, מסננים את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון. ושטפו את המסנן היטב עם 3 מיליליטר מאגר כביסה המכיל DNase. לאחר מכן שטפו את המסננת עם 15 מיליליטר מאגר כביסה ללא DNase. סובב את התאים, והשליך את הסופרנטנט.

כדי להסיר את פסולת התא והמיאלין, השעו מחדש את התאים ב-5 מיליליטר של מדיום שיפוע בצפיפות של 25% בטמפרטורת החדר והעבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר. מערבבים היטב את התאים והשיפוע עם פיפטינג עדין חוזר ונשנה. ואז סובב את תמיסת התא.

בתום ההפרדה, יש לשאוב בזהירות את מעיל המיאלין ואת הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. ולהשעות מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של מאגר כביסה נטול DNase. העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר, וסובבו אותם שוב, והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר כביסה קרה.