הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן סינפטית במודל חוץ גופי של טרשת אמיוטרופית לרוחב

קח נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של מכרסמים שגודלו על צלחת מצופה עם תחתית זכוכית המכילה מדיה.

תאים אלה מבטאים חלבון הקשור ל-ALS מקודד גנטית וחיישן ביולוגי של סידן.

החלף את המדיה במאגר דל אשלגן כלורי.

דגירה כדי לשמור על פעילות עצבית במנוחה ורמות סידן בסיסיות.

הרכיבו את המנה על במת מיקרוסקופ קונפוקלי ומקמו את צינור הזילוף.

באמצעות תאורת שדה בהיר, התמקדו בתאי העצב, ואז עברו להדמיה פלואורסצנטית.

באמצעות הלייזר של המיקרוסקופ, עורר את החיישן הביולוגי ורשום את פליטת הקרינה כדי לקבוע את רמות הסידן התוך-תאיות הבסיסיות.

לאחר מכן, שטפו את המנה עם מאגר אשלגן כלורי גבוה.

ריכוז האשלגן הגבוה מפרק את הנוירונים, ופותח תעלות סידן מגודרות מתח במסופים הפרה-סינפטיים. זה מאפשר זרימת סידן, אשר יוזמת פעילות סינפטית עצבית.

הסידן התוך תאי המוגבר נקשר לחיישן הביולוגי, וגורם לשינוי קונפורמציה המשפר את הקרינה.

המשך להקליט פלואורסצנטיות כדי למדוד שינויים בזמן אמת ברמות הסידן התוך תאי, וחשוף פעילות סינפטית עצבית.

48 שעות לאחר הטרנספקציה עם GCaMP6m, דגרו על הנוירונים הראשוניים בקליפת המוח של המכרסמים עם ACSF נמוך של אשלגן כלורי למשך 15 דקות. לאחר מכן הרכיב את הצלחת על פלטפורמת ההדמיה ודמיין את הקרינה GCaMP6m באמצעות מסנן FITC ומטרה פי 20 או פי 40. לאחר בחירת שדה ההדמיה והפעלת מיקוד מושלם, צלם תמונת סטילס בודדת עם ערוצי FITC וסמן פלואורסצנטי בשדה בהיר כדי לסמן גבולות עצביים.

לאחר מכן, התחל את "הפעל עכשיו" בתוכנת הרכישה ובצע את ההקלטה הבזאלית למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן החדירו ACSF המכיל 50 מילי-מולרי אשלגן כלורי לתאי העצב כפי שהודגם קודם לכן, והקליטו במשך חמש דקות. כאשר רכישת התמונה נעצרת, שמור את הניסוי והמשך לניתוח נתונים באמצעות התוכנה הקונפוקלית.

לניתוח תמונה, פתח את תמונות ה-Time-lapse ואת התוכנה הקונפוקלית, ויישר את התמונות על ידי לחיצה על תמונה, ואחריה עיבוד, ואחריו יישור המסמך הנוכחי. לאחר מכן בחר Align to the First Frame. בחר אזורי עניין לאורך הנויריטים באמצעות כלי בחירת ה-ROI, וסמן גם החזר ROI המייצג את עוצמת הקרינה ברקע. לאחר מכן, הפעל את פונקציית המדידה מלוח מדידת הזמן כדי למדוד פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן עבור החזר ה-ROI שנבחר. לאחר המדידה, ייצא את עוצמות הקרינה הגולמיות לתוכנת הגיליון האלקטרוני.