Name: מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למדו מעקב תאים חי בדגי זברה בעזרת מערכת PSmOrange הפוטוקונברטיבית. שיטה זו מאפשרת חקירת מקורות תאיים בהתפתחות עוברית ובמחלות תוך שימוש ברקעים טרנסגניים GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-O. Subach על אספקת הפלסמיד המקורי H2B-PSmOrange ולצוות מתקן הדגים שלנו לטיפול בדגים. אנו אסירי תודה למרכז ההדמיה של Nikon באוניברסיטת היידלברג על הגישה לציוד מיקרוסקופיה ולתוכנת ניתוח. אנו מודים על תמיכתו של מתקן הליבה להדמיית תאים חיים במנהיים ב-CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). עבודה זו נתמכה על ידי Excellenzcluster CellNetworks, EcTop תיאום מרחבי-זמני של תהליכי איתות (EcTop 2), אוניברסיטת היידלברג ל-C.A.B. והפקולטה לרפואה מנהיים של אוניברסיטת היידלברג וה-DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 ו-298/6-1) ל-M.C.

1. תמלול mRNA H2B-PSmOrange במבחנה טיהור mRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize את PSmOrange H2B המכיל pCS2 + פלסמיד באמצעות אנזים הגבלה NotI פי הוראות היצרן. הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות הגנות מתאימות כגון כפפות וחלוק מעבדה על מנת למנוע זיהום והשפלה mRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- DNA לינארית באמצעות שיטות המבוססות ערכת טיהור PCR או פנול, כלורופורם על פי פרוטוקולים של היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 מיקרוגרם של תבנית ה- DNA לינארית עבור שעתוק SP6-mRNA על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DNA על ידי הוספת 1.0 U RNase חינם DNaseI במשך 10-20 דק &#39;ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את ה- mRNA באמצעות RNA לנקות ערכה על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיל טוהר mRNA וריכוז, לזרז את mRNA על ידי הוספת 6 נתרן אצטט μl (3.0 M, pH 5.2) ו 150 μl 96% אתנול. דגירה מפתרון ixed ב -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ה- mRNA על ידי ספינינג הפתרון ב 18.407 XG במשך 45 דקות ב 4 ° C. מחק את הנוזל ו resuspend mRNA ב 150 μl 70% אתנול. מערבבים צנטריפוגות הפתרון עבור 15 דקות נוספות ב 4 ° C. מחק את הנוזל, לייבש את הגלולה במשך 5 דקות על קרח ו resuspend mRNA ב 20 מים חינם μl ultrapure RNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז והטוהר של mRNA על ידי מדידה photometric של דילול 1: mRNA 100 (mRNA 1 μl ב 99 μl מים חינם ultrapure RNase). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אחסון לטווח קצר, לשמור על פתרון mRNA ב -20 ° C. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על mRNA ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. H2B-PSmOrange mRNA Microinjection לעוברי דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ההזדווגות זוגות בלילה לפני הזריקה באמצעות TG (foxD3: GFP); TG (FLH: GFP) דג מהונדס כפול (או כל דג מהונדס GFP אחר). השאירו את הדגים מופרדים על ידי הצבת spacerביניהם כדי לקבוע את הזמן של הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את spacer בבוקר ההזרקה ולתת זוג דגים למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ההזדווגות זמן, לדלל את ה- mRNA H2B-PSmOrange לריכוז סופי של 130 pg / NL (במים חינם RNase) פתרון הזרקת μl העברת 6 לתוך נימי microinjection באמצעות קצה microloader. בדוק את עוצמת זריקה עם שקופית זכוכית מכוילת. התאם את לחץ ההזרקה להזריק 2 פתרון mRNA NL (260 pg). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הביצים לתוך צלחת פטרי פלסטיק מעוקר המכילים עובר 1x בינוני (E3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר 20 עד 30 עובר למנת הזרקה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 mRNA NL המכיל פתרון לתוך התא או סתם מתחת לתא בחלמון בשלב אחד התא 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים מוזרק לתוך צלחת פטרי שמכילה בינוני 1x E3, להסיר בדרך כלל מופרית או לא עוברים לפתח ולגדל אותם על 28 מעלות צלזיוס. הערה: o הגנת אורf עובר אינו נדרש לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים עוברי דג הזברה במדיום 1x E3 ולהוסיף 0.2 מ&quot;מ PTU (1-פניל-2 thiourea) לאחר gastrulation לעכב פיגמנטציה. שינוי המדיום פעמים ביום כדי למזער את הסכנה של זיהומים חיידקיים. </li></ol> 3. עובר והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ה- GFP (ירוק) ו PSmOrange (כתום / אדום) עובר להביע שיתוף באמצעות מיקרוסקופ משקפת מצוידת מנורת קרינה ומסנני פליטה מתאימות. מעביר את העוברים החיוביים לתוך פטרי צלחת סטרילי המכילה בינוני 1x E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים dechorionate תחת סטראו באמצעות מלקחיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עובר אחד בתוך שפופרת 1.5 מ&quot;ל המכיל 1.0 מ&quot;ל של מחומם מראש agarose התכה נמוכה 1.0% (אה&quot;ע) שהוכנו מים ultrapure באמצעות פיפטה לחתוך קצה (P200). הערה: מומלץ לחמם את אה&quot;ע 80 ° C ו להתקרר במשך 3-5 דקות ב RT לפני הטבעה העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העובר ב -150 אה&quot;ע μl לתוךתאיים coverglass ולהתאים את האוריינטציה של העובר, בצד הגבי למשל למטה בניסוי שתואר על A1R מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה + (או כל מיקרוסקופ מתאימה אחרת), באמצעות קצה פלסטיק משובח. כאשר אה&quot;ע הוא polymerized, למלא את התא במים דגים המכיל 0.2 מ&quot;מ PTU ו 0.02% אתיל 3-aminobenzoate methansulfonate (Tricaine) עבור הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה המדגם, לחכות 15 דקות כדי לקבוע במדויק את השפעת Tricaine. ההרדמה מונעת תנועות עוברות, אשר ניתן לנטר באמצעות סטראו מצויד תאורת brightfield. הערה: התאים ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים. </li></ol> 4. PSmOrange photoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ confocal ולסרוק את הדגימה כדי לזהות את האזור photoconvert באמצעות 488 ננומטר ו 561 nm לייזרים הדמיה GFP ו PSmOrange בהתאמה. הערה: השתמש A1R מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה + על sta הפוכהge TiEcontrolled ידי תוכנת הדמיה מיקרוסקופ ומצוידים 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים עבור photoconversion והדמיה. עם זאת, היישום הוא בהחלט לא מוגבל מיקרוסקופ זה כל עוד קווי לייזר לגיור הדמיה זמינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המטרה אוויר 20X למקומו (NA: 0.75; WD: 1.0 מ&quot;מ; FOV: 0.64 x 0.64 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדרות מיקרוסקופ הבא כדי לזהות את החלבון PSmOrange לפני photoconversion: 561 ננומטר לייזר, 0.74 mW הנמדדים המטוס מוקד מעל המטרה. הערה: זה מקביל ל -40% במערכת זו (מדידה במישור המוקד הוא הדרך היחידה לקבוע את כוח יעיל). התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לצרכים ניסיוניים כמו יעילות של זריקות H2B-PSmOrange יכול להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף גורמי זום כדי להדגיש את תחומי העניין. בהגדלות גדולות להפחית את זמן רכישת תמונה ולכן phototoxicity. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש Z- מחסנית כיסוי המבנההים של עניין באמצעות 488 ננומטר ו 561 nm לייזרים במצב רציף (מצב קו 1-&gt; 4). תקן ה- z צעד בין 1.0 ו -2.0 מיקרומטר. ממוצע קו ותדיר סריקה ניתן להשתמש כדי לייעל את איכות תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המדגם לבחור את האזור של כלי עניין (ROI) כדי להדגיש את האזור photoconvert. תקן את ההחזר על ההשקעה כאזור גירוי. בחר את מודול הפעלת תמונה / הלבנה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר על ידי סימון התיבה המתאימה ולהגדיר את לייזר 488 ננומטר עד 80% (כוח לייזר 1 mW הנמדדים המטרה). הגדר את מהירות הסריקה ל -0.5 שניות / מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את כלי העזר photoconversion (ND גירוי) וציין את ההגדרות photoconversion. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על הפקודה &quot;הוסף&quot; כדי לציין את פרוטוקול photoconversion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר &quot;שלב&quot; 1 בתפריט &quot;רכישה / הגירוי&quot; ל &quot;הרכישה&quot; ומציין את מספר התמונות להירכש לפני photoconversion בתפריט &quot;הלולאות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר &quot;שלב&quot; 2 עד &quot;Stimulation &quot;והזן את מספר אירועי גירוי להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם &quot;שלב&quot; 3 כמתואר עבור &quot;שלב&quot; 1. לחלופין, כנס המתנה &quot;שלב&quot; אחרי &quot;שלב&quot; 2 על ידי הזנת הזמן לחכות לפני הסיבוב האחרון של רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הפרמטרים נקבעים, להחיל את ההגדרה גירוי ולהפעיל את photoconversion. הערה: כוח לייזר, תדירות סריקה ומספר חזרות עבור כל סיבוב של photoconversion יכול להשתנות נבדלים העובר העובר. הגדרה להתחיל עם מוצג בטבלה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש Z- מחסנית הסופי באמצעות 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים החלת הגדרות כנ&quot;ל. הגדר את לייזר 640 ננומטר כדי להמחיש את PSmOrange המרה באמצעות כוח לייזר גבוהה (עד 4.5 mW). </li></ol> 5. העובר לרדת מעל אה&quot;ע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העובר המכיל קאמרית מן מיקרוסקופ. מוציאים בזהירות את העובר מן u agaroseלשיר מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העובר לתוך צלחת פטרי-פלסטיק חדש מעוקר או לתוך צלחת 6-היטב מעוקר המכיל E3 1x ו -0.2 מ&quot;מ PTU. דגירה העובר על 28 מעלות צלזיוס עד לשלב של פיתוח הרצוי. </li></ol> 6. ניתוח הגורל של תאים המבטאים חלבון photoconverted PSmOrange <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להטביע את העובר כפי שמתואר תחת נקודות 3.3 ו -3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ confocal ולסרוק את הדגימה כדי לזהות תאים photoconverted (640 ננומטר) במבנה מהונדס GFP עניין (488 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש Z- מחסנית מכסה את המבנים של העניין באמצעות 488 ננומטר, 561 ננומטר ו 640 nm לייזרים במצב רציף (מצב קו 1-&gt; 4). תקן ה- z צעד בין 1.0 ו -2.0 מיקרומטר. ממוצע קו ותדיר סריקה ניתן להשתמש כדי לייעל את איכות תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באחת מהשיטות הבאות כדי לזהות תאים, אשר GFP שיתוף מפורש ואת חלבון photoconverted. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מותאם ללקוח תמונת פיג&#39;י אוטומטית3 J מאקרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שזירת ערימת מסמכי המקור באמצעות תוסף &quot;GaussianBlur&quot; (→ תהליך → מסנן → GaussianBlur) ולחסר את הערימות החלקות מהמקור באמצעות תוסף &quot;מחשבון תמונה&quot; (Image מחשבון → תהליך →). את הצעד הזה כדי לחזות מבנים של עניין ולהפחית את הזמן חישובית לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל סף ספציפי הערוצים הירוקים ומרחיקים בצבע האדום על מנת להדגיש את תאי photoconverted (→ תמונה → התאם → סף). השתמש באפשרות &quot;לנתח חלקיקים&quot; כדי לזהות את תחומי סף עם הגדרה מתאימה (→ לנתח → לנתח חלקיקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוסף &quot;מחשבון תמונה&quot; ולהציג את ROIs חופף בערוץ ירוק ומרחיקות האדומים בצהוב (→ מחשבון תמונת → תהליך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת הדמיה מיקרוסקופ להערכת נתוני 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את המחסנית3D באמצעות אפשרות הצגת נפח הצגה (→ צפה נפח צג → תפריט ויזואליזציה 3D). השתמש בממשק הגרפי כדי לבחור את הערוצים הירוקים, אדום ומרחיקות האדומים, להתאים את הבהירות הניגודיות לחתוך את מחסנית 3D כדי להדגיש את אזור photoconverted (איור 1). הערה: שיטות דומות כדי לנתח את הנתונים זמינים ברוב התוכנות הנפוצות לניתוח תמונה. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein%2C+PSmOrange%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li>
<li>Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+habenulae+of+zebrafish+develop+in+prosomere+2+dependent+on+Tcf7l2+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function.</a> Neural Development. 8, 19(2013).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li>
<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling ">http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling </a> (2015).</li>
<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עובר מהונדסים נושאת כתבי ניאון סייע ביסודו להבין התפתחות עוברית. עם זאת, יש עדיין הצורך החיוני עבור יזמים כדי להקל על ויזואליזציה הספציפי של מבנים בפרט. בהיעדרם, החוקרים מסתמכים על טכניקות כגון photoconversion של חלבוני ניאון כדי לברר על מוצאם והתפתחותם של מבנה האינטרס שלהם. זה בתורו הוא תנאי חיוני כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח שלה. התקדמות טכנית בתחום דג הזברה כעת לאפשר להחליף את FP בקווים מהונדסים עם, למשל, חלבוני photoconvertible באמצעות נקישה בתיווך CRISPR...

טכניקות הדמיה המשפרות באופן אקספוננציאלי מאפשרות מעקב אחר תהליכי התפתחות לאורך תקופות זמן של עד כארבעה ימים רצופים3. בדגי הזברה ובמערכות רבות אחרות של מודלים של בעלי חיים, תאים ספציפיים, רקמות, מבנים אקסונליים או כלי דם מסומנים על ידי חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים או לפעמים אדומים או צהובים כדי להקל על ההדמיה. עם זאת, ברוב הקווים הטרנסגניים הטרנסגן אינו מתבטא באופן ספציפי בתאים המעניינים אלא גם במבנים נוספים, מה שמפריע למעקב מדויק של תאים בודדים או קבוצות תאים.
חלבונים פלואורסצנטיים הניתנים להמרה מתאימים היטב למעקב אחר תאים במהלך ההתפתחות העוברית. התנאים המוקדמים ליישום חלבונים כאלה הם אופי ארוך טווח, טווח פליטה מופרד היטב בעת המרה ופלואורסצנטיות בהירה. חלבונים הניתנים להמרה לאור זמינים כוללים את אלה המשנים את טווח הפליטה שלהם עם ההמרה כגון Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 או Dendra27 ואחרים שהם פלואורסצנטיים רק כאשר הם מופעלים באור (PAmCherry8, PAGFP9 או PATagRFP10). עם זאת, היישומים שלהם למעקב אחר תאים בבעלי חיים טרנסגניים קיימים מוגבלים מכיוון שהם כוללים לעתים קרובות מצב פלואורסצנטי ירוק או אינם עומדים בכל הקריטריונים לעיל. רק לאחרונה, סובאך ועמיתיו דיווחו על חלבון PSmOrange, שמשנה את פליטתו מכתום/אדום לאדום רחוק עם המרת אור ויושם בהצלחה בתאים בתרבית ובתאים מתורבתים שהוזרקו לעכברים2.
כדי לחקור את התאמת החלבון למעקב אחר תאים בעובר חי, יצרנו מבנה ביטוי להזרקת מיקרו של H2B-PSmOrange מתויג גרעיני לעוברי דג זברה. אנו מוצאים כי החלבון ממלא את כל התנאים המוקדמים למעקב מוצלח אחר תאים ברקע טרנסגני של GFP במהלך 4 הימים הראשונים (ואולי יותר) של ההתפתחות העוברית של דג הזברה. במהלך תקופה זו, רוב אירועי נדידת התאים מסתיימים בדגים, מה שהופך את מערכת PSmOrange לתוספת מצוינת לערכת הכלים של דג הזברה.

<table><tbody><tr><td>ערכת טיהור PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute ערכת ניקוי</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות אלפא</td><td>פסטר מפלסטיק</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>מקורי H2B-PSmOrange פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>הפלסמיד המתואר במאמר הוא זמין במעבדת Carl</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 מערכת Coverglass גרמנית&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH גרמניה</td><td>ללא מספר</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; 20X air objective&nbsp;</td><td>Nikon GmbH גרמניה</td><td>ללא מספר</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH גרמניה/הדמיה מעבדתית</td><td>ללא מספר</td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב תאים דג הזברה gfp מהונדס שימוש במערכת photoconvertible psmorange

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

ההתפתחות המהירה של עוברי דג הזברה השקופים (Danio rerio) בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי של תאים ורקמות מאפשרת לדמיין תהליכי התפתחות כפי שהם מתרחשים בבעל החיים החי. ניתן לתייג תאים מעניינים על ידי שימוש במקדם ספציפי לרקמה כדי להניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי (FP) ליצירת קווים טרנסגניים. שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים הניתנים להמרה למטרה זו מאפשר בנוסף לעקוב במדויק אחר מבנים מוגדרים בתחום הביטוי. הארת החלבון באזור העניין, משנה את ספקטרום הפליטה שלו ומדגישה תא או מקבץ תאים מסוים ומשאירה תאים טרנסגניים אחרים בצבעם המקורי. מגבלה עיקרית היא היעדר מקדמים ידועים למספר רב של רקמות בדג הזברה. לעומת זאת, מסכי מלכודות גנים ומשפרים יצרו משאבים טרנסגניים עצומים המתייגים באופן דיסקרטי את כל המבנים העובריים בעיקר עם GFP או במידה פחותה FPs אדומים או צהובים. גישה לעקוב אחר מבנים מוגדרים ברקעים טרנסגניים כאלה תהיה להכניס בנוסף חלבון הניתן להמרה בכל מקום, שניתן להמיר בתא/ים המעניינים. עם זאת, החלבונים הניתנים להמרה לאור הזמיניםכוללים מצב פליטה ירוק ו/או בתדירות נמוכה יותר 1 ולכן לעתים קרובות לא ניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר תאים ברקע FP של קווים טרנסגניים קיימים. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו את מערכת PSmOrange עבור דג הזברה2,3. מיקרו-הזרקה פשוטה של mRNA סינתטי המקודד צורה גרעינית של חלבון זה מסמנת את כל גרעיני התא עם פלואורסצנטיות כתומה/אדומה. עם המרה ממוקדת של החלבון, הוא מעביר את ספקטרום הפליטה שלו לאדום רחוק. היעילות הקוונטית והיציבות של החלבון הופכות את PSmOrange לכלי מעולה למעקב אחר תאים עבור דגי זברה ואולי מיני טלאוסט אחרים.

איור 1 מדגים דוגמה של מערכת photoconversion PSmOrange. מתחם האצטרובל הוא מבנה משומר ב diencephalon הגבה חוליות. כמו חוליות רבות אחרות, מורכבים זה מורכב של איבר האצטרובל במרכז של diencephalon ותאי parapineal צדדי-השמאל. ניסויים משחררים רפרוף אלגנטיים אבל גוזל זמן הראו כי תאי parapineal מקורן בחלק הקדמי של איבר האצטרובל 13. ב TG (foxD3: GFP); TG (FLH: GFP) עוברים מהונדס, שני תאים האצטרובל ואת parapineal מסומנים במהלך הפיתו...

הקמנו את מערכת ה-PSmOrange הניתנת להמרה ככלי רב עוצמה, ישר קדימה וזול למעקב אחר תאים in vivo ברקעים טרנסגניים של GFP. פרוטוקול זה מתאר את יישומו במערכת המודל של דג הזברה.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

המטרה הכוללת של טכנולוגיית ההמרה הפוטו-כימית PSmOrange היא לעקוב אחר תאים בבעל חיים חי במהלך התפתחות עוברית ובמהלך מחלה. שיטה זו יכולה לתת מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של ההתפתחות, כגון חשיפת מקורם של תאים המתפתחים לרקמות ואיברים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן ליישמה ברקעים טרנסגניים של GFP.ניתן להחיל שיטה זו גם בתחומי מחקר שונים, כגון התחדשות, התקדמות גידולים פלישניים ופלישה. לאחר יצירתם והטמעתם של עוברים המבטאים PSmOrange ו-GFP בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מקם את העובר תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי והשתמש בעדשת אוויר 20x ובלייזרים של 488 ו-561 ננומטר כדי לסרוק את הדגימה ולזהות אזור להמרה פוטונית. כדי לזהות את חלבון ה-PSmOrange לפני ההמרה הפוטונית, השתמש בלייזר של 561 ננומטר בעוצמה של 0.74 מיליוואט, כפי שנמדדה במישור המוקד מעל העדשה, והתאם את עוצמת הלייזר לפי הצורך.כווננו את מקדמי הזוום כדי להדגיש את האזור המעניין ולהפחית את זמן רכישת התמונה ואת הרעילות הפוטו-כימית. השתמשו בלייזרים באורכי גל של 488 ו-561 ננומטר במצב רצפי (sequential mode) ובצעד Z שבין 1.0 ל-2.0 מיקרומטרים, ורכשו Z stack המכסה את המבנים המעניינים. כווננו את ממוצע הקווים (line average) ואת תדר הסריקה כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית.לאחר מכן סרקו את הדגימה ובחרו בכלי אזור העניין (ROI) כדי לסמן את השטח להמרה פוטוכימית לפני קיבוע ה-ROI כאזור הגירוי. בחרו במודול הלבנת הפוטו-אקטיבציה, סמנו את תיבת הבחירה להפעלת לייזר 488 nanometer, ולאחר מכן הגדירו את לייזר 488 nanometer ל-80% ואת מהירות הסריקה ל-0.5 seconds per frame. በመקום זאת, פתחו את כלי העזר להמרה פוטוכימית ולחצו על 'Add' כדי להגדיר את פרוטוקול ההמרה הפוטוכימית.בתפריט הגירוי של הרכישה, הגדירו את השלב הראשון (Phase One) כרכישה, ובבקרת הלולאות (loops), ציינו את מספר התמונות שירוכשו לפני הפוטו-המרה. הגדירו את השלב השני (Phase Two) כגירוי והזינו את מספר אירועי הגירוי שיבוצעו. התאימו את השלב השלישי (Phase Three) כפי שמתואר עבור השלב הראשון.במידת הצורך, ניתן להוסיף שלב המתנה לאחר שלב שתיים על ידי הזנת זמן ההמתנה לפני סבב רכישת התמונות האחרון. לאחר הגדרת הפרמטרים, יש להחיל את הגדרות הגירוי ולהפעיל את הפוטו-המרה. הגדרות המיקרוסקופ הן קריטיות עבור פוטו-המרה של PSmOrange.כדי להבטיח פוטוקונברסיה מוצלחת, ניתן לצלם את העובר מיד לאחר הניסוי כדי לזהות את חלבון ה-PSmOrange שעבר פוטוקונברסיה. אם הקונברסיה לא הצליחה, יש לחזור על הפרוצדורה. בעזרת לייזרים של 488, 561 ו-640 ננומטר, ובקיבוע הלייזר של 640 ננומטר להספק גבוה, עד 4.5 מיליוואט, רכשו z stack סופי עם ההגדרות שפורטו לעיל.כדי להוציא את העובר, הסיר את התא מהמיקרוסקופ והשתמש בפינצטה כדי להוציא את העובר מהאגרוז. העבר את העובר לכלי פטרי פלסטיקי סטרילי חדש, או לפלטה סטרילית בעלת 6 בארות, המכילה 0.2 millimolar PTU בתוך E3. הדגר את העובר בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עד לשלב הפיתוח הרצוי. כדי לנתח את גורל התאים המבטאים חלבון PSmOrange שעבר המרה פוטוכימית, טמיע מחדש את העובר בהתאם לפרוטוקול הכתוב.תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי, סרקו את הדגימה כדי לזהות תאים שעברו המרה פוטונית במבנה התורשני של GFP הנבדק. השתמשו בלייזרים באורכי גל של 488, 561 ו-640 ננומטר כדי לרכוש z stack עם מרווח קבוע של 1 עד 2 מיקרומטר במצב רצפי המכסה את המבנים. באמצעות תוכנת Image J Fiji, זהו את התאים המבטאים GFP והחלבון שהומר פוטונית בו-זמנית.שכפלו את הערימה המקורית, השתמשו בתוסף Gaussian Blur ובמחשב התמונות (image calculator) כדי להחסיר את הערימות המוחלקות מהמקוריות. החילו ספי thresholds ספציפיים על הערוצים הירוק והאדום הרחוק כדי להבליט את התאים שעברו פוטו-המרה. לאחר מכן, השתמשו בכלי Analyze Particles כדי לזהות את אזורי הסף בערוץ הירוק עם הגדרה מתאימה.חזרו על שלב זה עבור ערוץ התוכין האדום הרחוק. פתחו את תוסף מחשבון התמונות (image calculator) כדי לזהות תאים בעלי קולוקליזציה. הציגו בצהוב את ה-ROIs החופפים בערוץ הירוק או בערוץ האדום הרחוק באמצעות כלי ניתוח החלקיקים (Analyze Particles).באמצעות תוכנת NIS-Elements, בצעו הערכת נתונים בתלת-ממד והציגו את הערימה (stack) בתלת-ממד באמצעות אפשרות Show Volume View. לאחר מכן, השתמשו בממשק הגרפי כדי לבחור את הערוצים הירוק, האדום והאדום הרחוק, כווננו את הבהירות והניגודיות, וגזרו את ערימת התלת-ממד כדי להבליט את האזור שעבר המרה פוטונית. מוצג כאן דוגמה למערכת הפוטו-המרה PSmOrange בעוברים טרנסגניים של דגי זברה מסוג FOXD3 floating head GFP.ב-26 שעות לאחר ההפריה, שני מקבצי תאים בחלק הקדמי של בלוטת האצטרובל עברו המרה פוטוכימית ודוגמו מיד. החלבון זוהה באמצעות לייזר אדום רחוק של 640 ננומטר, אך לא באמצעות לייזר של 561 ננומטר. בתאים אלו, ביטוי ה-GFP פחת בתחילה עקב פוטובליצ'ינג.ב-52 HPF, GFP ו-H2B PSmOrange זוהו בתאים המבטאים את חלבון H2B PSmOrange שעבר המרה פוטו-כימית. חלק קטן מתאים אלו הרכיבו את ה-parapineal בצד שמאל של המוח. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על מקור תאי ה-parapineal בבלוטת האצטרובל anterior pineal, ומראה את ישימותה של טכניקת ה-PSmOrange בעוובר חולייתים חי טרנסגני ל-GFP.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוח מעקב תאים בעוברים שעברו מניפולציה גנטית, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להיררכיות המולקולריות העומדות בבסיס התפתחות התא.

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

כאן אנו מציגים שיטה להפעלה פוטו-אקטיבית של חלבוני פלואורסצנציה הניתנים להמרה פוטו-כימית (PCFPs) בעובר דג זבוב חי, ומעקב המשך אחר החלבון שהומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים תאיים העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חולייר חי.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

סרטון זה מדגים מעקב אחר גיוס לויקוציטים באמצעות זחלי דגי זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק הניתן להמרה פוטו-מיטבית. הזרקה מראש של חיידקים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי אדום לתוך שלפוחית העין וגרימת המרת אור מאפשרת תצפית על נדידת לויקוציטים, פגוציטוזה ופיזורם בכל הגוף, ומספקת תובנות חשובות לגבי דינמיקת התגובה החיסונית.

מעקב לויקוציטים מבוסס פוטו-המרה בדגי זברה טרנסגניים נגועים בחיידקים

Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך זמן במבחנה.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול יעיל, קל לשימוש עבור הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה העוברים על תרביות תאים, תא חי הדמיה, כמו גם פרוטוקול להכין ראשי תאים מהמוח דג זברה למבוגרים.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

למדו מעקב תאים חי בדגי זברה בעזרת מערכת PSmOrange הפוטוקונברטיבית. שיטה זו מאפשרת חקירת מקורות תאיים בהתפתחות עוברית ובמחלות תוך שימוש ברקעים טרנסגניים GFP.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

גלה סרטונים נוספים