Name: Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למד ניתוח עצמות ארוכות באגפיים אחוריים בעכברים ובידוד מח עצם בשיטת סרכוז מהירה. שיטה זו שומרת על שלמות הרקמה ומתאימה לניתוחים היסטולוגיים ותרביות תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NCI מס' U54CA143803, CA163124, CA093900 ו-CA143055 ל-K.J.P. המחברים מודים לחברים בהווה ובעבר במעבדת Weilbaecher, במיוחד לקתרין Weilbaecher, Michelle Hurchla ו-Hongju Deng, ולחברי המכון האורולוגי של בריידי, במיוחד לחברי מעבדת Pienta על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

כל העבודה בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בהתאם להמלצות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.
1. דיסקציה של עצם ארוכה בגפה האחורית
<ol>
	<li>המתת חסד של העכבר בהתאם להנחיות המוסדיות.</li>
	<li>מקם את העכבר במצב שכיבה והצמד על ידי הצמדת כל ארבע הרגליים דרך כריות כפות העכבר מתחת למפרק הקרסול.</li>
	<li>מרססים את העכבר באתנול 70%, ומטפטפים היטב את הרגליים.</li>
	<li>בצע חתך קטן מימין לקו האמצע בבטן התחתונה, ממש מעל הירך.</li>
	<li>הארך את החתך במורד הרגל ומעבר למפרק הקרסול.</li>
	<li>משוך את העור לאחור וחתוך את שריר הארבע ראשי המעוגן לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד הקדמי של עצם הירך ולהצמיד החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח.</li>
	<li>עם להב המספריים כנגד הצד האחורי של עצם הירך, חתוך את שרירי הירך האחוריים ממפרק הברך.</li>
	<li>משוך לאחור את העור ואת שרירי הירך האחורי המעוגנים לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך כדי לחשוף את הצד האחורי של עצם הירך ולהצמיד החוצה מהרגל, תוך הנחת הסיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח.</li>
	<li>בעזרת המלקחיים, החזק את הקצה הדיסטלי של עצם הירך, ממש מעל מפרק הברך. הנח את להבי המספריים משני צידי פיר הירך לכיוון מפרק הירך, היזהר לא לחתוך לתוך עצם הירך עצמה.</li>
	<li>לאחר שהגעתם לראש הירך, המסומן על ידי המספריים הנפתחים מעט, סובבו את המספריים כשהלהב העליון של המספריים נע ישירות מעל ראש הירך כדי לעקור את עצם הירך, היזהרו לא להצמיד את העצם מתחת לראש הירך.</li>
	<li>אחזו בחלק העליון של פיר הירך בעזרת המלקחיים, חתכו את הרקמה הרכה מראש הירך כדי לשחרר אותה מהאצטבולום.</li>
	<li>משוך את כל עצם הרגל, כולל עצם הירך, הברך והשוקה, למעלה והרחק מהגוף, וחתוך בזהירות את רקמת החיבור והשריר המחברים את הרגל לעור.</li>
	<li>האריכו יתר על המידה את מפרק הקרסול והשתמשו שוב במספריים בתנועת פיתול כדי לפרק את השוקה.</li>
	<li>אוחז בקצה הדיסטלי של השוקה, נזהר לא לחתוך את הגידים, משוך את השוקה למעלה והרחק מהגוף ומלוח הסיכה.</li>
	<li>חתוך את כל רקמת החיבור שנותרה המחברת את העצם הארוכה לעכבר בברך.</li>
	<li>הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך ולשוקה.</li>
	<li>עבור כל יישום הדורש שהעצם תישאר שלמה (היסטולוגיה, היסטומורפומטריה, בדיקות ביומכניות וכו'), המשך עם פרוטוקולים פנימיים סטנדרטיים (כמו ב-4-7). כדי לבודד את מח העצם, המשך לסעיף 2.</li>
</ol>
2. הכנת עצם ארוכה לבידוד מח עצם
<ol>
	<li>בעזרת המלקחיים, אחוז בעצם הירך כשהפיקה פונה החוצה והקצה הפרוקסימלי (ראש הירך) כלפי מטה.</li>
	<li>האריכו יתר על המידה את מפרק הברך והשתמשו במספריים בתנועת פיתול כדי לעקור את השוקה ועצם הירך.</li>
	<li>חותכים כל רקמת חיבור המחזיקה את עצם הירך והשוק יחד.</li>
	<li>בעזרת המלקחיים, אחוז בעצם הירך כשהצד הקדמי פונה החוצה והקצה הפרוקסימלי (קצה ראש הירך) כלפי מטה.</li>
	<li>הנח את המספריים במעלה פיר הירך אל הקונדילים.</li>
	<li>סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדילים, הפיקה והאפיפיזה כדי לחשוף את המטאפיזה.</li>
	<li>הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לעצם הירך באמצעות מלקחיים, מספריים ו-Kimwipes.</li>
	<li>בעזרת המלקחיים, אחוז בשוק כשהצד הקדמי פונה החוצה והקצה הדיסטלי (קצה הקרסול) כלפי מטה.</li>
	<li>אם האפיפיזה הטיביאלית שלמה, הנח את המספריים במעלה פיר השוקה אל הקונדילים.</li>
	<li>סובב בעדינות את המספריים קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדיל והאפיפיזה כדי לחשוף את המטאפיזה.</li>
	<li>הסר כל שריר או רקמת חיבור נוספת המחוברת לשוק באמצעות מלקחיים, מספריים ו-Kimwipes.</li>
</ol>
3. בידוד מח עצם
<ol>
	<li>דחוף מחט של 18 גרם דרך החלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.</li>
	<li>הנח את העצמות הארוכות (מקסימום 2 עצם הירך ו-2 שוקה) לתוך הצינור, קצה הברך כלפי מטה וסגור את המכסה.</li>
	<li>קן את צינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מ"ל בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינורות המקוננים ב-≥10,000 x g במיקרו-צנטריפוגה למשך 15 שניות.</li>
	<li>ודא שמח העצם סובב מהעצמות על ידי בדיקה חזותית. העצמות צריכות להיראות לבנות וצריכה להיות גלולה חזותית גדולה בצינור הגדול יותר.</li>
	<li>השליכו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל עם העצמות.</li>
	<li>השעו את מח העצם בתמיסה מתאימה (למשל, PBS, אמצעי תרבית, מאגר FACS) והמשיכו בפרוטוקול הניסוי (בידוד DNA, RNA או חלבון, ניתוח FACS או תרבית תאים ראשונית).</li>
</ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה להסרת עצמות ארוכות אחוריות של עכבר ובידוד מח עצם לאחר מכן. שיטה זו שומרת על השלמות המבנית והתאית הגבוהה של העצמות ומח העצם ויש לה זמן טיפול נמוך, מה שממזער את הסבירות לשבר הנגרם על ידי המשתמש או ניקוד עצם שעלולים להשפיע על ניתוחים במורד הזרם. בנוסף, שיטת הצנטריפוגה לבידוד מח עצם אינה מחייבת חיתוך העצם כדי לחשוף את חלל מח העצם או נוזל כדי לשטוף את מח העצם, מה שמפחית נקודות זיהום פוטנציאליות. יתר על כן, טכניקת הצנטריפוגה היא בעלת תפוקה גבוהה יחסית עם זמן מעשי נמוך יותר משיטות אחרות, ובכך מפחיתה את זמן העיבוד.
שונות גבוהה טבועה במחקרי עכברים in vivo עקב שונות פנוטיפית גבוהה מעכבר לעכבר. על מנת למקסם את ההשפעה המחקרית של מחקרי עכברים יקרים ועתירי עבודה, קריטי למזער את שגיאת הניסוי הטכנית9,10. הזמן מהקרבת בעלי חיים ועד לניתוח במורד הזרם או קיבוע רקמות מציג שונות ניסויית שעשויה להתגבר על שינויים עדינים ולהפחית הבדלים גדולים בין קבוצות. לכן, עיבוד מהיר של דגימות חיוני לניתוח נתונים מדויק. טכניקות ניתוח העצם הארוכות ובידוד מח העצם המתוארות כאן מותאמות לעיבוד מהיר של בעלי חיים ודגימות כדי להפחית את השונות הטכנית.
ניתן ליישם פרוטוקול זה באופן נרחב בתחומי מחקר רבים, כולל חקירת רקמת העצם עצמה או חקירת תאי מח העצם. בנוסף, גישה פשוטה זו לדיסקציה ארוכה של עצם תאפשר לחוקרים בתחומים קשורים לחקור ישירות את תרומות העצם על מנת להרחיב את הידע שלנו על תפקוד לקוי של מח העצם בפתולוגיות שאחרת לא נחקרו.

חקר עצמות ארוכות ותאי מח העצם הוא מרכזי במספר עצום של דיסציפלינות מחקר, כולל, אך לא רק, ביולוגיה של העצם, ביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה, המטולוגיה וביומכניקה. העצם היא איבר דינמי ביותר שיחד עם הסחוס יוצר את השלד כדי לספק תמיכה מכנית מפני העמסה והגנה על האיברים הפנימיים. בנוסף, המרכיבים המינרליים של העצם מהווים כיור אחסון למולקולות האיתות הקריטיות סידן וזרחן, כמו גם גורמים אחרים1. לבסוף, העצמות מאכלסות את מח העצם, ויחד עם אוסטאובלסטים יוצרי עצם פעילים מטבולית ואוסטאוקלסטים סופגי עצם, מספקות את נישת תאי הגזע הדרושה לתחזוקה של אוכלוסיות תאים המטופויאטיים ולימפואידים.
עצם ומח עצם מושפעים בהפרעות רבות, מה שמוביל לעתים קרובות לתפקוד לקוי של מח העצם, כאבי עצמות חמורים ושבר פתולוגי. עצם היא אתר שכיח של גרורות בגידולים מוצקים רבים, בעיקר סרטן השד וסרטן הערמונית, שבהם תאי הגידול מתקשרים ישירות עם נישת מח העצם כדי להתחיל את מעגל הקסמים של גרורות בעצמות ולעקור תאי גזע המטופויאטיים2,3. ממאירויות המטופויאטיות כולל מיאלומה ולוקמיה מאופיינות בתפקוד לקוי של מח העצם כמו גם בחוסר רגולציה של עיצוב מחדש של עצם בריאה1. הפרעות שלד לא ממאירות אחרות הן גם תחומי מחקר פעילים, כגון דלקת מפרקים ניוונית, אוסטאופורוזיס, עקמת ורככת. אפילו אצל אדם בריא אחרת, כשל ביומכני בעצם מוביל לשבר כואב. כל ההפרעות הללו מייצגות תחומי מחקר פעילים במטרה לזהות אמצעי מניעה ומשטרי טיפול חדשים להפחתת תחלואה ותמותה.
כדי לחקור את שפע התפקידים של העצם ומח העצם, הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים, זה קריטי לחוקרים שתהיה להם שיטה סטנדרטית פשוטה ויעילה לדיסקציה של עצמות ארוכות של עכבר לעיבוד מהיר של ניסויים גדולים in vivo. פרוטוקול הדיסקציה המתואר כאן מתאים לכל ניתוחי העצמות הארוכות כולל הדמיה ex vivo, היסטולוגיה, היסטומורפומטריה ובדיקות חוזק, בין היתר. באופן דומה, שיטת בידוד מח עצם סטנדרטית עם התאוששות גבוהה של תאי מח עצם ושונות נמוכה בין משתמשים חשובה לניתוח ניסיוני כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) או PCR כמותי (qPCR) כמו גם יישומים במורד הזרם כגון תרבית תאים ראשונית של תאי מח עצם.

<table><tbody><tr><td>Pinboard Pinboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לדיסקציה 70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>דיסקציה</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 גרם מחט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוצנטריפוגה</tr><tr><td>0.5 מ"ל צינור</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוצנטריפוגה</tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine הינד לימב ארוך עצם dissection ובידוד מח העצם

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

חקר העצם ומח העצם הוא קריטי בתחומי מחקר רבים כולל ביולוגיה בסיסית של העצם, אימונולוגיה, המטולוגיה, גרורות סרטניות, ביומכניקה וביולוגיה של תאי גזע. עם זאת, למרות חשיבות העצם במצבים בריאים ופתולוגיים, מדובר באיבר שאינו נחקר במידה רבה בשל היעדר ידע מיוחד בנתיחת עצם ובידוד מח עצם. עכברים הם אורגניזם מודל נפוץ לחקר השפעות על עצם ומח עצם, מה שמחייב שיטה סטנדרטית ויעילה לדיסקציה ארוכה של עצם ובידוד מח עצם לעיבוד קבוצות ניסוי גדולות. אנו מתארים הליך דיסקציה פשוט להסרת עצם הירך והשוק המתאים ליישומים במורד הזרם, כולל אך לא רק ניתוח היסטומורפולוגי ובדיקת חוזק. בנוסף, אנו מתארים הליך מהיר לבידוד מח העצם מהעצמות הארוכות באמצעות צנטריפוגה עם זמן טיפול מוגבל, אידיאלי למיון תאים, תרבית תאים ראשונית, או מיצוי DNA, RNA וחלבון. הפרוטוקול יעיל לעיבוד מהיר של דגימות כדי להגביל את שגיאות הניסוי, והוא מתוקנן כדי למזער את השונות בין משתמש למשתמש.

הפרוטוקול המתואר כאן עבר אופטימיזציה לנתיחה מהירה של פמור (עצם הירך) וטיביה (עצם השוק) של עכבר עם מינימום נזק לרקמת העצם. טכניקה זו מתאימה למספר ניתוחים המשכיים, כולל מחקרי ביומכניקה, היסטומורפומטריה (איור 1A - B) והיסטולוגיה (איור 1C)4,7. שחזור תלת-ממדי מייצג ב-micoCT להיסטומורפומטריה (איור 1A - B) מדגים כי הן העצם הספוגית (cancellous bone) והן המעטפת הקורטיקלית נשמרות, מה שמאפשר כימות מדויק של פרמטרים מבניים סטנדרטיים להיסטומורפומטריה של העצם, כולל מספר טרבקולות, עוביהן והמרווח ביניהן; נפח העצם; ועובי קורטיקלי, בין יתר המדדים8. חתך היסטולוגי מייצג מראה טיביה מקובעת בפורמלין ומנוונת סידן, צבועה ב-H&amp;E (איור 1C). התמונה מדגימה את השמירה על שלמות העצם המסיידת ושל מח העצם התאי לצורך ניתוח היסטולוגי.
הליך בידוד מח העצם שומר על סטריליות חלל מח העצם, כרוך במניפולציות מעטות להפחתת זיהומים, ואינו דורש חיתוך של העצם הארוכה, ובכך מפחית את אובדן תנובת מח העצם. מח עצם זה מתאים ליישומים רבים בהמשך, כולל ציטומטריית זרימה (flow cytometry)5 ואנליזות PCR. בנוסף, ניתן להשתמש בהליך זה כדי לבודד מח עצם לתרבית ראשונית של תאי מח עצם, כולל אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים (איור 2A - B)4,6.
<img alt="סריקות CT של עצם ותמונת היסטולוגיה; ניתוח מבני ותצפית על פרטים תאיים." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 1"> 
איור 1. ניתוחים היסטומורפולוגיים והיסטולוגיים של עצם ארוכה בעכבר. שחזור microCT תלת-ממדי של טיביה (שוקה) של עכבר המראה את (A) הקליפה הקורטיקלית החיצונית ואת (B) העצם הטראבכולרית (סרגל קנה מידה = 0.5 mm). (C) צביעת H&amp;E היסטולוגית של טיביה שעברה דה-קלציפיקציה וחיתוך (4x). התמונות Courtesy של Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="חתך היסטולוגי ואנליזה של תרבית תאים, תמונות מיקרוסקופיות, מורפולוגיה של רקמה, בדיקת דגימה." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 2"> 
איור 2. תרבית תאי מח עצם ראשוניים להבדלה של אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים. (A) צביעת TRAP לאוסטאוקלסטים רב-גרעיניים לאחר 7 ימים במצע אוסטאוקלסטוגני (4x). (B) צביעת Alkaline phosphatase (צבע סגול) לאוסטאובלסטים וצביעת alizarin red (צבע אדום) למינרליזציה לאחר 21 ימים במצע אוסטאוגני. התמונות באדיבות של Katherine Weilbaecher, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ארה"ב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדיסקציה של עצמות ארוכות של הגפיים האחוריות (עצם הירך והשוקה) מעכבר המעבדה. אנו מתארים עוד טכניקה מהירה לבידוד מח עצם מעצמות אלו המשתמשת בצנטריפוגה להסרת מח עצם מחלל מח העצם.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

המטרה הכללית של הליך נתיחה זה של עצמות ארוכות ובידוד מוחי עצם היא להסיר במהירות ובאופן שיטתי את העצמות הארוכות ולאסוף את מוח העצם לצורך ניתוחים המשכיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הקשורות לביולוגיה של מוח העצם, גרורות סרטניות ואימונולוגיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שתהליך הנתיחה מהיר וסטנדרטי, והליך בידוד מוח העצם הוא סטרילי למדי. התחילו במיקום העכבר בתנוחה גבהית (supine).לאחר מכן, מקבעו את כל ארבעה כריות כף הרגל מתחת למפרק הקרסול וריססו את העכבר ב-70% ethanol, תוך הרטבה יסודית של הרגליים. לאחר מכן, בצעו חתך קטן מימין לקו האמצע בבטן התחתונה, מעל הירך, והרחיבו את החתך במורד הרגל ומעבר למפרק הקרסול. משכו את העור לאחור.לאחר מכן, גזרו את שריר ה-quadriceps המעוגן לקצה הפרוקסימלי של ה-femur כדי לחשוף את הצד האנטריורי של עצם הירך, והצמידו את השריר הרחק מהרגל באמצעות סיכה בזווית של 45 מעלות מהלוח. כאשר המספריים מונחים כנגד הצד הפוסטריורי של ה-femur, גזרו את שרירי ה-hamstrings מהמפרק של הברך. לאחר מכן, משכו לאחור את העור ואת שרירי ה-hamstring המעוגנים לקצה הפרוקסימלי של ה-femur כדי לחשוף את הצד הפוסטריורי של העצם, והצמידו את שרירי ה-hamstring הרחק מהרגל, כאשר הסיכה מונחת בזווית של 45 מעלות.בעזרת הפינצטה, אחזו את הקצה הדיסטלי של ה-femur ממש מעל מפרק הברך. לאחר מכן, הנחיתו את להבי המספריים משני צדי גוף ה-femur לכיוון מפרק הירך. לאחר ההגעה לראש ה-femur, סובבו את המספריים והעבירו את הלהב העליון ישירות מעל ראש ה-femur כדי לבצע פריקה של ה-femur.כעת אחזו בחלק העליון של גוף הפמור (עצם הירך) באמצעות הפורספס, וגזרו את הרקמה הרכה מהראש של הפמור כדי לשחרר את הפמור מהאצטבולום (הגומחה של עצם האגן). לאחר מכן משכו את כל עצם הרגל, כולל הפמור, הברך והטיביה (שוק), כלפי מעלה והרחקה מהגוף, וגזרו בזהירות את רקמת החיבור והשרירים המחברים את הרגל לעור. כאשר כל רקמת החיבור הוסרה, פריסו את מפרק הקרסול מעבר לטווח התנועה הרגיל וסובבו את המספריים כפי שהודגם כעת כדי לגרום לפריקה של הטיביה.אחזו בקצה הדיסטלי של הטיביה, תוך הקפדה שלא לקרע את הגידים, ומשכו את הטיביה למעלה והתרחקו מהגוף ומלוח הפינים. לאחר מכן, הסירו כל רקמה חיבורית שנותרה ומחוברת לעצם הארוכה באזור הברך, וכל שריר או רקמה חיבורית נוספים המחוברים לפמור ולטיביה. כדי להכין את העצם הארוכה לבידוד מח העצם, אחזו בפמור כאשר הפטלה פונה החוצה וראש הפמור פונה כלפי מטה.בצעו פלסיה (פריסה) של מפרק הברך וסבבו את המספריים כדי לנתק את הטיביה (שוקה) מהפמור (ירך). לאחר מכן, הסירו כל רקמה מחברת המחברת בין הפמור לטיביה. בשלב הבא, אחזו בפמור כאשר הצד הקדמי פונה החוצה והראש הפמורלי פונה כלפי מטה, והנחו את המספריים במעלה גוף הפמור לכיוון הקונדילים.סובב בעדינות את המספריים הלוך ושוב כדי להסיר את הקונדילים, את הפיקה ואת האפיפיזה, ובכך לחשוף את המטאפיזה. לאחר מכן, השתמש בפינצטה, במספריים ובניגוני Kimwipes כדי להסיר כל רקמת שריר או רקמה מחברת נוספת המחוברת לפמור. בשלב הבא, אחז בטיביה כאשר הצד הקדמי פונה החוצה וקצה הקרסול פונה כלפי מטה.אם האפיפיזה של השוקה (tibial epiphysis) שלמה, הנחו את המספריים במעלה גוף השוקה לכיוון הקונדילים וסובבו את המספריים בעדינות קדימה ואחורה כדי להסיר את הקונדילים ואת האפיפיזה, ובכך לחשוף את המטאפיזה של השוקה (tibial metaphysis). לאחר מכן, הסירו כל שריר או רקמה חיבורית נוספת המחוברים לשוקה, כפי שהודגם זה עתה. כדי לאסוף את מחית העצם, דחפו תחילה מחט בכיול 18 gauge דרך תחתיתו של מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 milliliter.לאחר מכן, מקמו את העצמות הארוכות בתוך הפקעת, כאשר קצה הברך פונה כלפי מטה, וסגרו את המכסה. הכניסו את פקעת המיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 מיליליטר לתוך פקעת מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, וסובבו את הפקעת במיקרוצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g או יותר למשך 15 שניות. ודאו באמצעות בדיקה ויזואלית שמוח העצם הוצא מהעצמות בתהליך הסבב.העצמות צריכות להיראות לבנות, ומשקע גדול צריך להיות נראה בתוך המבחנה הגדולה יותר. לאחר מכן, השליכו את העצמות הנמצאות במבחנת המיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 milliliters, והשעיו את מחית העצם בתמיסה המתאימה לניתוח הרצוי בהמשך. טכניקת נתיחה מהירה זו מתאימה למספר ניתוחים המשכיים, כולל היסטומורפומטריה והיסטולוגיה.ואכן, כפי שמוצג בשחזור תלת-ממדי זה של micro-CT היסטומורפומטרי מייצג, הן העצם הספוגית והן המעטפת הקורטיקלית נשמרות, מה שמאפשר כימות מדויק של הפרמטרים המבניים הסטנדרטיים להיסטומורפומטריית עצם. בחתך היסטולוגי מייצג זה של טיביה מקובעת בפורמלין, שעברה דקאלציפיקציה ונצבעה ב-H and E, ניתן להבחין בשימור השלמות של הן העצם המהתגבשת והן מח העצם התאי לצורך אנליזה היסטולוגית. יתרה מכך, מח העצם שבודד באמצעות הליך זה מתאים ליישומים רבים של שלבים מאוחרים יותר, כולל תרבית תאים ראשונית של אוסטאוקלסטים או אוסטאובלסטים.לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את הטכניקה תוך כמעט שבע דקות, מהניתוח של העצם הארוכה ועד לבידוד מחול השומן, במידה שהיא מבוצעת כהלכה. במהלך ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור למקם את העכבר בצורה שתקל על הניתוח. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון FACS או תהליכים אחרים של תא בודד, כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשינויים באוכלוסיות תאי מחול השומן.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לנצח במהירות את העצמות הארוכות של עכברים ולהפריד את מחית העצם באמצעות סנטריפוגה.

murine-hind-limb-long-bone-dissection-and-bone-marrow-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד מח עצם שלם טרי מגפיו האחוריות של העכבר כדי לחקור פגמים שלמים ב- BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה.

קציר מח עצם מגפה אחורית של עכבר

פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

כאן אנו מציגים פרוטוקול המייצר כמויות גדולות של מונוציטים עכבריים ממח עצם הטרוגני ליישומים תרגומיים. בהשוואה לאחרות, שיטה חדשה זו מסייעת להפחית את מספר בעלי החיים המוקרבים ומורידה עלויות על ידי הימנעות משיטות יקרות כגון הפרדת תאים מגנטיים בשיפוע גבוה (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

כאן, מתוארת שיטה מבוססת ציטומטריית פוספופלואו לניתוח איתות במורד הזרם של מסלולי mTORC1, JAK/STAT5 ו-MAPK בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית חריפה שהושתלו בעכברים ומתקבלים מאספיראטים של מח עצם. רמות p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ו-p-ERK1/2 נמדדות בו זמנית באמצעות ציטומטר זרימה ספקטרלי מהדור הבא עם רגישות גבוהה.

ציטומטריית פוספו-פלואו תוך-תאית של השתלות קסנו-השתלות שמקורן בלוקמיה מיאלואידית חריפה

למד ניתוח עצמות ארוכות באגפיים אחוריים בעכברים ובידוד מח עצם בשיטת סרכוז מהירה. שיטה זו שומרת על שלמות הרקמה ומתאימה לניתוחים היסטולוגיים ותרביות תאים.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

גלה סרטונים נוספים