Name: CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: חקור שחזור ביטוי דיסטרופין בשריר באמצעות CRISPR/Cas9 בתאי גזע iPSC. שיטה זו מציעה אסטרטגיה טיפולית חדשנית לטיפול בדיסטרופיה שרירית דושן באמצעות תאי שריר אוטולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טאנג וינטרוב תמכו בחלקם על ידי NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

<ol><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Batchelor, C. L., Winder, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparks%2C+signals+and+shock+absorbers%3A+how+dystrophin+loss+causes+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy.</a> Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).</li>
<li>Gregorevic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+genes+to+striated+muscles+using+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors.</a> Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).</li>
<li>Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects+of+gene+therapy+clinical+trials+for+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351 (6271), 407-411 (2016).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 400-403 (2016).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351 (6271), 403-407 (2016).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).</li>
<li>Amoasii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+restores+dystrophin+expression+in+a+canine+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 362 (6410), 86-91 (2018).</li>
<li>Eisen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+abnormalities+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+generated+from+Duchenne+muscular+dystrophy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).</li>
<li>Marion, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+acquire+embryonic+stem+cell+characteristics+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).</li>
<li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li>
<li>Sacco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+telomeres+and+stem+cell+exhaustion+model+Duchenne+muscular+dystrophy+in+mdx%2FmTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.</a> Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Transplantation+of+Myogenic+Progenitor+Cell+Derived+Exosomes+to+Improve+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).</li>
<li>Ousterout, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Communications. 6, 6244(2015).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Glass, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cartilage+with+inducible+and+tunable+immunomodulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties.</a> Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

ניוון שרירים duchenne (dmd) היא מחלה תורשתית הרסנית בסופו של דבר מאופיין על ידי חוסר של הדיסטרופין, המוביל ניוון שרירים פרוגרסיבי1,2. התוצאות שלנו להפגין הדיסטרופין המשוחזר הביטוי הגן בתוך Dmdmdx ipsc-נגזר בתאי הקדמון על ידי הגישה של CRISPR/Cas9-תיווך exon23 מחיקה. לגישה זו יש שלושה יתרונות.
ראשון, שיצרנו iPSCs מ Dmdmdx העכבר נגזר פיברופיצוצים באמצעות וקטור RNA שאינו משולב. מגוון של שיטות פותחו כדי ליצור iPSCs, כג...

ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא אחד הdystrophies השרירים הנפוצים ביותר והוא מאופיין על ידי העדר הדיסטרופין, המשפיעים על 1 של כ 5,000 בנים יילוד ברחבי העולם1. הפסד של הדיסטרופין הפונקציה גן תוצאות פגמים שרירים מבניים המוביל ניוון מתקדם מיואיים1,2. רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV)-תיווך מערכת הריפוי גנטי נבדק כדי לשחזר את ביטוי הדיסטרופין ולשפר את תפקוד השריר, כגון החלפת גנים באמצעות מיקרו-הdystrophins (μ-Dys). עם זאת, הגישה raav מחייב זריקות חוזרות כדי לקיים את הביטוי של חלבון פונקציונלי3,4. לכן, אנחנו צריכים אסטרטגיה שיכולה לספק ביעילות ולשחזר לצמיתות הדיסטרופין ביטוי גנטי בחולים עם DMD. העכברהmdx dmd, מודל העכבר עבור dmd, יש מוטציה נקודה ב אקסון 23 של הגן הדיסטרופין המציג מוקדם הפסקת קודון ותוצאות חלבון מעוגל לא פונקציונלי חסר הדיסטרוc מסוף מחייב לתחום. מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו השימוש crispr/Cas9 טכנולוגיה כדי לשחזר ביטוי גנטי הדיסטרופין על ידי תיקון גנטי מדויק או מוטציה אקסון מחיקה של חיה קטנה וגדולה5,6,7. ארוך ואח '8 דיווחו על השיטה לתיקון מוטציה גן הדיסטרופין ב dmdmdx העכבר germline על ידי תיקון homology מכוון (HDR) מבוסס Crispr/Cas9 הגנום עריכה. אל-רפאי ואח '9 דיווח כי raav יכול ביעילות לבלו את מוטציה 23 בעכברים הדיסטרומנוונת. במחקרים אלה, gRNAs עוצבו ב introns 20 ו 23 כדי לגרום כפול נתקע DNA הפסקות, אשר שוחזר באופן חלקי את הביטוי הדיסטרופין לאחר תיקון DNA דרך הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ). אפילו יותר מרגש, אמאסיאני ואח '.10 דיווחו לאחרונה על יעילות והיתכנות של raav-תיווך CRISPR לערוך גנים בשחזור הביטוי הדיסטרופין במודלים כלבים, צעד חיוני ביישום קליני בעתיד.
DMD גם גורם להפרעות תא גזע11. עבור נזק שרירים, בתאי גזע שרירים מגורים לחדש תאי שריר לאחר בידול שריר. עם זאת, מחזורים רצופים של פציעה ותיקון להוביל קיצור של טלומרים בתאי גזע שריר12, ו דלדול מוקדמת של בריכות תאי גזע13,14. לכן, שילוב של טיפול אוטוולוגי בתאי גזע עם עריכת הגנום כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין יכול להיות גישה מעשית לטיפול DMD. The CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מספקת את האפשרות של יצירת אוטוולוגי גנטית מתוקן בתאי גזע המושרה pluripotent iPSC) עבור התחדשות שרירים תפקודית ולמנוע סיבוכים נוספים של DMD ללא גרימת דחייה החיסונית. עם זאת, iPSCs יש סיכון של היווצרות הגידול, אשר יכול להיות להקלה על ידי הבידול של iPSC לתוך תאים מיוגני קדמון.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש ללא שילוב וירוס סנדאי כדי לתיכנות מראש באמצעות הפנים של עכבריםMdx dmd לתוך iPSCs ולאחר מכן לשחזר ביטוי הדיסטרופין על ידי CRISPR/Cas9 הגנום מחיקה. לאחר אימות של מחיקה Exon23 ב-iPSC על ידי הגנוטיפים, אנו הבדיל מתוקן הגנום iPSC לתוך ושלתי מיוגניים (MPC) באמצעות בידול מיוגני הנגרמת על ידי MyoD.

<table><tbody><tr><td>מכשירים כירורגיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט 31 מד</td><td>שונים&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חתך חד</td><td>אמנים שונים&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אזמלים סטריליים</td><td>שונים&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>אמנים שונים&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום פיברובלסטים (עבור 100 מ"ל של מדיום שלם)</td><td>מספר קטלוגי</td> <td>של החברה</td><td>נפח</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (55 מ"ל</td>)<td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.1 מ"ל</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה אנטי-פטריית 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>87 מ"ל</td></tr><tr><td>עוברי סרום בקר מאופיין</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td> תמיסת TVP <td>של 1 מ"ל</td></tr><tr><td>(עבור 500 מ"ל של תמיסה מלאה)</td><td>מספר קטלוגי</td> <td>של החברה</td><td>סרום</td></tr><tr><td>עוף</td><td>נפח Gibco</td><td>16110-082</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>186 מ"ג</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> מלח חוצצת פוספט <td>עד 500 מ"ל</td></tr><tr><td>טריפסין (2.5%)</td><td>תרמו</td><td>15090046</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>מדיום גידול mES (עבור 500 מ"ל של תמיסה מלאה)</td> <td>מספר קטלוגי</td> <td>של החברה</td><td>נפח</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (55 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>408.5 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי </td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>75 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי לוקמיה גורם מעכב (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>500 &mu; </td></tr><tr><td>תוסף מעכב L MEK/GS3 EMD</td><td>Millipore Corp</td><td>CS210510-500UL</td><td>500 &mu; L</td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>אין לאחסן את המדיה הסלולרית ES יותר מ-4 שבועות ועם מעכבים לא יותר משבועיים.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>mES בינוני קפוא (עבור 50 מ"ל של תמיסה מלאה)</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>נפח</חזק></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>24.9 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מאופיין</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי לוקמיה גורם מעכב (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>50 &mu; L</td></tr><tr><td>שם החומר/ציוד</td><td>מספר קטלוגי</td><td>של החברה</td><td>RRID</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין/0.53 מ"מ EDTA</td><td>CORNING</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Thermo scientific</td><td>J19943-k2</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Accutase</td><td>SIGMA</td><td>A6964</td><td>תמיסת ניתוק תאים</td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-מצומד עז-אנטי-עכבר</td><td>נוגדן Invitrogen</td><td>A32723</td><td>AB_2633275</td></tr><tr><td>Alexa488-מצומד עז-אנטי-ארנב נוגדן</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td></td>AB_2633280-Alexa555-מצומד</tr><tr><td>עז-אנטי-ארנב</td><td>Invitrogen</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>AB_2633281-Anti-AFP</td><td>Thermo scientific</td><td>RB-365-A1</td><td></td></tr><tr><td>AB_59574 אנטי-&אלפא;-חלק אקטין שריר (D4K9N) XP</td><td>CST</td><td>19245S</td><td>AB_2734735</td></tr><tr><td>אנטי דיסטרופין</td><td>תרמו</td><td>PA5-32388</td><td>AB_2549858</td></tr><tr><td>אנטי-LIN28A (D1A1A) XP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8641S</td><td></td></tr><tr><td>AB_10997528 אנטי-MYH2</td><td>DSHB</td><td>mAb2F7</td><td>AB_1157865</td></tr><tr><td>אנטי-Nanog-XP</td><td>CST</td><td>8822S</td><td>AB_11217637</td></tr><tr><td>אנטי-Oct-4A (D6C8T)</td><td>CST</td><td>83932S</td><td>AB_2721046</td></tr><tr><td>אנטי-Sox2</td><td>abcam</td><td>ab97959</td><td>AB_2341193</td></tr><tr><td>נגד SSEA1(MC480)&nbsp;</td><td>CST</td><td>4744s</td><td></td></tr><tr><td>AB_1264258 אנטי-TH (H-196)</td><td>סנטה קרוז&nbsp;</td><td>sc-14007</td><td>AB_671397</td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז כתם חי (500x)</td><td>Thermo</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI/Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0580L/R0734L</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>Millipore</td><td>205805-250MG</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV&nbsp;</td><td>תאגיד וורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>תאים מוכשרים</td><td>TakaRa</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td><td>Thermo</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR מגיב ליזה (תא)</td> <td>VIAGEN BIOTECH</td><td>302-C</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (1 U/mL)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין הידרוכלוריד</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP26535</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין פלזמה בקר</td><td>SIGMA</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ערכת מיצוי ג'ל QIAEX II (500)</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר, סוג A</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה קשיח נגד דהייה עם וקטור DAPI</td><td></td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>הזרקת קטמין HCL</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>45822</td><td></td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>NEB</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>lenti-CRISPRv2-blast</td><td>Addgene</td><td>83480</td><td></td></tr><tr><td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td><td>Addgene</td><td>99377</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&nbsp; &nbsp;</td><td>Addgene</td><td>60625</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP16 עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2</td><td>Addgene</td><td>60626</td><td></td></tr><tr><td>עכבר על עכבר (M.O.M.) ערכת בייסיק</td><td>וקטור</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I מדיה סרום מופחתת</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 4,000</td><td>אלפא Aesar</td><td>AAA161510B</td><td></td></tr><tr><td>פוליברן</td><td>SIGMA</td><td>TR1003</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; BioCoat פולי-D-ליזין/למינין תרבית שקופית</td><td>CORNING</td><td>CB354688</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max Premix</td><td>TakaRa</td><td>R045</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>507-PKP</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19453980</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus ערכת טיטרציה</td><td>abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>ערכת קשירה מהירה</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN פלסמיד פלוס ערכת מידי (100)</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT ערכת תמלול הפוך</td><td>תרמו מדעי</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr>מרכז מחקר מולקולרי<td>RNAzol RT</td><td>, INC</td><td>RN 190</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase מאגר תגובה</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>מרק נהדר שונה</td><td>פישר BioReagents</td><td>BP9729-600</td><td></td></tr><tr><td>ViralBoost Reagent (500x)</td> <td>ALSTEM</td><td>VB100</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר ipsc-נגזר ושלתי

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

ניוון שרירים duchenne (DMD) היא מחלה מתקדמת חמורה שרירים נגרמת על ידי מוטציות הגן הדיסטרופין, אשר בסופו של דבר מוביל לתשישות של תאים שריר קדמון. באשכולות באופן קבוע הכולל מרווח מחדש palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) לעריכת גנים יש את הפוטנציאל לשחזר את הביטוי של הגן הדיסטרופין. אוטוולוגי המושרה תאי גזע רב-עוצמה (iPSCs)-בתאי שריר נגזר (MPC) יכול לחדש את בריכת גזע/מחולל קדמון, לתקן נזק, ולמנוע סיבוכים נוספים ב-DMD ללא גרימת תגובה חיסונית. במחקר זה, אנו מציגים שילוב של CRISPR/Cas9 ו-iPSC שאינם משולבים טכנולוגיות להשיג ושלתי שרירים עם ביטוי חלבון הדיסטרופין התאושש. בקצרה, אנו משתמשים בווקטור שאינו שילוב של סנדאי כדי ליצור קו iPSC מתוך פיברותקיעות העורי של עכברMdx dmd. לאחר מכן אנו משתמשים באסטרטגיית המחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין באמצעות הצטרפות לא הומוולוגי של גן הדיסטרופין ממוסגר מחדש. לאחר אימות PCR של exon23 דלדול בשלוש מושבות מ 94 לאסוף מושבות iPSC, אנו להבדיל iPSC לתוך MPC על ידי דוקסיציקלין (חמצון)-ביטוי המושרה של MyoD, גורם שעתוק מפתח לשחק תפקיד משמעותי בוויסות בידול שריר. התוצאות שלנו מציגות את הכדאיות של שימוש באסטרטגיית מחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין ב-iPSC-נגזר MPC, אשר יש פוטנציאל משמעותי לפיתוח טיפולים עתידיים לטיפול DMD.

הקמת מערכת העור של Dmdmdx שמקורם ipsc. הדגמנו את היעילות של יצירת העכבר iPSCs מ Dmd מעכבריםmdx נגזר העור פיברופיצוץ באמצעות שילוב חינם וקטורים תכנות. איור 1A הפגינו כי המראה של תא גזע עובריים (ESC)-כמו מושבות בשלושה שבועות לאחר ההדבקה. אנו מעריכים את היעילות של האינדוקציה iPSC ידי לחיות פוספספטאז אלקליין (AP) הכתם; איור 1B מראה שאחוזי התאים של AP-חיוביים היו סביב 1.8% על-ידי ניתוח facs. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 ו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול Cas9 מבוסס exon23 מחיקה כדי לשחזר ביטוי הדיסטרופין ב-iPSC מ Dmdmdx העכבר הנגזר פיברוהפיצוצים ולהבדיל ישירות iPSCs לתוך תאים מיוגניים מיוגנים (mpc) באמצעות ט-על מערכת ההפעלה myod.

CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

דושן הוא ניוון שרירים הגורם מתיש מוקדם מדי של תאים הצאצאים שריר. זהו אחד הדיסטרופיות השריריות החמורות ביותר. כדי לקדם התחדשות שרירים תפקודית, אנו משתמשים בעריכת גנים בתווך CRISPR/Cas9 כדי לשחזר ביטוי דיסטרופין בתאי האב של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים.לעריכת הגנים CRISPR-Cas9 יש פוטנציאל לשחזר ביטוי גנים של דיסטרופין. תאי שריר אוטולוגיים שמקורם ב- iPSC יכולים לחדש את נקבובית תאי הגזע, לתקן נזק ולמנוע סיבוכים נוספים ב- DMD מבלי לגרום לתגובה חיסונית. סוכנים שונים של תאי iPS לתוך תאי אבי העורף Myogenic הפחיתו את הסיכון של גידול מחדש בראשית בתאי iPS.מספר טיפולים המשלבים תאים מונעים אוטומטית תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי שרירים עם תיקון גנטי בתיווך CRISPR-Cas9 מבטיחים אסטרטגיות מבטיחות לטיפול בניוון שרירים של דושן. טכנולוגיה זו יכולה לשמש לטיפול במחלות מולדות רבות על ידי עריכה גנטית של תאי גזע אוטולוגיים, כולל מחלות לב, מוח ודם. הראינו שהדגמה של גישה זו יכולה לספק לקוראים ניסיון בטיפול בתכנות מחדש של תאים ועריכת גנים, מה שנותר אתגר.תחת מיקרוסקופ הפוך, לבחון את המושבות של תאי גזע עובריים עכבר נגוע. סמן את המושבות בתחתית המנה באמצעות סמן האובייקט בדיו עצמית. החל טבעות שיבוט משומנים כדי לכסות את מושבות התא המסומנות.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA לכל טבעת שיבוט והצבו את הצלחת באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, להעביר את התאים מתעכלים עם 100 מיקרוליטר פיפטה טיפים 48-well צלחות תרבות המכיל 250 מיליליטר של MES צמיחה בינונית. אין לארוב את התאים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו 85% לחות.כאשר הם קוראים 70%confluence, לבחור את בארות עם תאים בוגרים היטב ולהוסיף 250 מיליליטר של פתרון TVP לעיכול במשך 30 דקות. לאחר מכן, להעביר את תרבות התא מכל באר לצלחת שישה סנטימטרים. חזור על החלת טבעות שיבוט ודגירה במשך מספר פעמים עד שיבוטים אחידים, בצורת מעונות מתקבלים.עכשיו, לעכל את iPSCs העכבר מוכן על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון TVP. מעבירים את תרבות התאים לצלחת 24 באר מצופה פיברונקטין וג'לטין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שהתאים מגיעים ל-50%, עברו ל-500 מיקרוליטרים של מדיום תרבות טרי המכיל שמונה מיקרוגרם למיליליטר פוליברין.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון החלקיק lentiviral iPSCs העכבר. דגירה התאים במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לקבוע את הריכוז המינימלי של Blasticidin ו Hygromycin B אשר בחצי שיעור להרוג בתוך 24 שעות.הוסף את המדיה של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר Blasticidin ו 100 מיקרוגרם למיליליטר Hygromycin B לתאים, לחכות שלושה ימים, ולבחור את התאים שנותרו חסידים כמו תאים נגועים מייצבים. לעכל את iPSCs העכבר שנבחר עם 0.5 מיליליטר של פתרון TVP, כל באר בצלחת חדשה 24 באר, ותאי דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, פיפטה iPSCs לתוך תאים בודדים לספור את התאים עם תא ספירת תאים.בחר כ -150 תאים בודדים מתעכלים ולדלל עם MES בינוני לתוך צלחת 10 ס"מ, תרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר כ-10 ימים, תחת מיקרוסקופ הפוך, השתמשו ב-10 טיפים סטריליים זעירים כדי לבחור מושבות בודדות ולהעביר כל מושבה ל-50 מיקרוליטרים של פתרון TVP בצלחת של 96 בארות. לעכל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.קטיף שיבוט ידני אמין הוא קריטי להצלחה של קצירת CRISPR / Cas9 בעריכת תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה. לאחר מכן, להעביר ולחלק את התאים מתעכלים מכל באר לעוד שתי צלחות תרבות 96-well. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד 70% confluent.עם מושבות התא ב 70%confluence, להסיר את המדיום בצלחת 96 באר. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של ריאגנט Lysis המכיל 1%Proteinase K פתרון לכל באר והעבר את ה-lysate לצלחת PCR נוספת של 96 באר. לאטום את צלחת PCR עם אטמים דבק להידגר את הצלחת במחזור תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות כדי ללטף את התאים ולנפח את Proteinase K.Then, בצינור PCR, להוסיף שני microliters של lysate, 10 microliters של 2x DNA פולימראז Premix, 7 microliters של מים ללא DNase ומיקרוליטר אחד של פריימרים DMD Exon23.התחל את תגובת PCR על פי כתב היד. לאחר מכן, לטעון את תגובת PCR מסופק עם 2.2 microliters של מאגר טעינה על 2%agarose ג'ל. הפעל את הג'ל ב 100 עד 150 וולט במשך 30 דקות ולבדוק את הג'ל תחת אור UV.בפרוטוקול זה, שני RNAs מדריך כי לאגף את המוטנט Exon23 תוכננו. לאחר הפסקות דו-גדיליות מתווכו Cas9 והצטרפות סוף לא הומולוגית, מוטציה Exon23 נמחק, המאפשר ייצור דיסטרופין קטום אך פונקציונלי. כדי למנוע את הדליפה של פתרון טריפסין, אנחנו צריכים להחיל גריז באופן שווה על החלק התחתון של הטבעות.השילוב של עריכת גנום CRISPR/Cas9 עם מערכת הפעלה מונעת של MyoD מספק אסטרטגיה בטוחה, אפשרית ויעילה להשתלה אוטולוגית בחולים ניוון שרירים דושן עם תאי האב הבסיסי התאוששות גנים.

crisprcas9-technology-restoring-dystrophin-expression-ipsc-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

פרוטוקול זה כולל נהלים מפורטים לבידוד תאים שמקורם בשתן מחולי ניוון שרירים; תכנות מחדש יעיל ומהיר שלהם באמצעות התמרת נגיף סנדאי.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע ויוו ג'ין לב עריכה בעכברים באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-Associated (rAAV)-מתווכת משלוח של CRISPR. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נוקאאוט ספציפיות הלב בעכברים כמחנכת, ומציע אסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול dystrophic קרדיומיופתיה ב ניוון שרירים דושן.

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור תפקוד הלב בעכברים ניוון שרירים דושן transiently על ידי משתילים exosomes נגזר נורמליים ובתאים myogenic.

טיהור והשתלות של תאים ובתאים Myogenic נגזר Exosomes כדי לשפר את תפקוד הלב בעכברים Dystrophic שרירים דושן

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור מיובלסטים נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9, החל מתכנון של רנ"א מנחים ועד לשיבוט תאי ואפיון של שיבוטים נוק-אאוט.

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

חקור שחזור ביטוי דיסטרופין בשריר באמצעות CRISPR/Cas9 בתאי גזע iPSC. שיטה זו מציעה אסטרטגיה טיפולית חדשנית לטיפול בדיסטרופיה שרירית דושן באמצעות תאי שריר אוטולוגיים.

CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי

גלה סרטונים נוספים