Name: זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למדו שיטת CLas-DETECTR לזיהוי מהיר של Candidatus Liberibacter asiaticus בצמחי הדרים בשטח. השיטה משלבת הגברת רקומבינאז פולימראז עם CRISPR-Cas12a ומספקת תוצאות תוך 90 דקות בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית R &amp D המפתח הלאומית של סין (2021YFD1400805), תוכנית המדע והטכנולוגיה הגדולה R&D של מחוז ג'יאנגשי (20194ABC28007), פרויקטים של מחלקת החינוך של ג'יאנגשי (GJJ201449), והחדשנות השיתופית של המחקר המדעי החקלאי המודרני במחוז ג'יאנגשי (JXXTCX2015002(3+2)-003).

1. בניית ה-CLas-DETECTR
הערה: הבנייה של CLas-DETECTR היא תהליך בן ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א והדמיית תוצאות. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.
<ol><li>הכנת פתרונות<ol><li>הכן מאגר A: 20 mM NaOH ב 6% PEG 200. עבור 100 מ"ל, יש להוסיף 113 מ"ג של NaOH ו-6 גרם של PEG 200 ל-80 מ"ל של H2O בבקבוק. לדגור את הבקבוק באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד כל PEG 200 מומס. לאחר מכן, הוסף H2O לנפח של 100 מ"ל.</li>
		<li>הכן פתרון B: עבור כל תגובה, הוסף 10 μL של מאגר RPA, 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, ו- 3.9 μL של ddH2O לנפח סופי של 15.5 μL. הערה: F-RPA-RNRf ו-R-RPA-RNRr הם הפריימרים המשמשים בבדיקה נגד הגן NRDB . ראו טבלה 1 לרצף.</li>
		<li>הכן פתרון C: עבור כל תגובה, הוסף 1 μL של מדווח ssDNA, 3 μL של מאגר NEB 3.1, 1 μL של crRNA, 4 μL של Cas12a, ו 11 μL של ddH2O לנפח סופי של 20 μL. הערה: אם יש דוגמאות רבות לזיהוי, צור נפח גדול של פתרון B ופתרון C, ו- aliquot מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד דנ"א כולל בהדרים הערה: כדי לחסוך זמן ולהפוך שיטה זו למתאימה לזיהוי CLas בשדה, הגישה המבוססת על פוליאתילן גליקול אלקליין (PEG) שימשה להשגת תמציות צמחים גולמיות להגברת DNA22,23<ol><li>עלי הדר שימשו בפרוטוקול זה. ראשית, אגרוף חמישה דיסקיות עלה מתוך עלה. לאחר מכן, הכניסו את דיסקיות העלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, והוסיפו 200 מיקרוליטר של חיץ A. הערה: בשטח, נקו תחילה את העלים אם יש אבק המכסה אותם. ניתן לחתוך את דיסקיות העלים באמצעות המכסה של צינור 1.5 מ"ל כדי למנוע זיהום צולב. רקמות הדרים אחרות, כגון שורשים, גבעולים, פירות ופרחים, יכולות לשמש גם בפרוטוקול זה.</li>
		<li>טוחנים את דיסקי העלים באופן ידני עד לקבלת מוט פלסטיק.</li>
		<li>השאירו את הצינור ללא הפרעה למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בסופרנטנט להגברת DNA. הערה: ניתן להשהות את הבדיקה כאן, וניתן לאחסן את תמציות הצמחים הגולמיות שהופקו בשיטת אלקליין-PEG בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך שנה אחת לפחות. עצי התפוז המתוק של ניוהול (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) המוצגים בסרטון גודלו בעציץ מלא בתערובת של 9/3/1 (v/v/v) אדמת כבול / ורמיקוליט / פרלייט ונשמרו בבית זכוכית הממוקם בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. העצים הנגועים ב-HLB חוסנו על ידי השתלה עם ניצני ניוהול חיוביים ל-CLas. העצים הנגועים ב-HLB והלא נגועים ב-HLB אושרו על ידי PCR. CLas זוהה באמצעות זוג הפריימרים (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) המכוון לגן הסמן הספציפי ל-CLas nrdB. בצד השני, ניתן למצוא תסמינים אופייניים של HLB, כתמים ועלים מצהיבים על עצים חיוביים ל-CLas, אך לא על עצים שליליים ל-CLas.</li>
	</ol></li>
	<li>הגברה איזותרמית של דנ"א<ol><li>הוסף 1 μL של סופרנטנט משלב 1.2.3 ו-1 μL של MgOAc (ריכוז סופי של 14 mM) לתמיסה B וערבב היטב.</li>
		<li>במעבדה, דגרו אותם באינקובטור פשוט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הערה: בשטח, החזק את הצינורות ביד למשך 15 דקות. כמו כן, מומלץ לדגור צינורות באינקובטור פשוט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות אם התנאים מאפשרים זאת.</li>
	</ol></li>
	<li>תצוגה חזותית של תוצאות<ol><li>מוסיפים 10 μL מהתערובת משלב 1.3.2 לתמיסה C ומערבבים היטב.</li>
		<li>לדגום אותם בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.</li>
		<li>הרכיבו משקפי מגן וצפו באות הפלואורסצנטי הירוק המשתחרר מכתב ה-ssDNA המסומן ב-5' 6-פלואורסצין ב-5' וב-quencher הפלואורסצנטי ב-3' באמצעות מכשיר לגילוי פלואורסצנטי ידני (אורך גל עירור: 440 ננומטר, אורך גל פליטה: 500 ננומטר). הערה: אות פלואורסצנציה ירוק יכול להימשך מספר ימים, עדיף התראה: האור הנפלט על-ידי ההתקן לזיהוי פלואורסצנציה מזיק לעיניים. הקפידו להרכיב משקפי מגן לפני שתתבוננו בתוצאות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מבחן ספציפיות
הערה: כדי לבדוק את הספציפיות של CLas-DETECTR, חיידק הריזוספרה אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודד במעבדה24 היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR.
הערה: לא ניתן לתרבת קנדידטוס ליבריבקטר (CLas). ניתן להשיג דנ"א CLas רק מהפקת דנ"א גנומי מרקמות הדרים הנגועות ב-CLas. Xcc הוא הגורם הסיבתי של מחלת הדרים חשובה אחרת, קנקן הדרים. זן Burkholderia stabilis 1440 הוא חיידק אנטי-Xcc שבודד במעבדה. לכן, נעשה שימוש בזנים טהורים לכל שלושת החיידקים האלה
<ol><li>חלץ את הדנ"א הגנומי החיידקי (gDNA) באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית חיידקית בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש במים כבקרה שלילית.</li>
	<li>בצע PCR באמצעות רצועות צינור PCR של 0.2 מ"ל עם מכסים אופטיים בתערובת תגובה של 25 μL המכילה 1 μL של F-RPA-RNRf, 1 μL של R-RPA-RNRr, 12.5 μL של Ex Taq גרסה 2.0 בתוספת צבע, 1 μL של תבנית DNA, ו- 9.5 μL של H2O.<ol><li>השתמש בתנאי התגובה הבאים של מחזור תרמי: דקה אחת ב- 98 °C (88 °F); ואחריו 35 מחזורים של 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, 15 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; ואז 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ולהחזיק ב 16 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הפעל את מוצרי ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% ב- 120 V למשך 15 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע qPCR בתערובת תגובה של 20 μL המכילה 0.8 μL של F-RPA-RNRf, 0.8 μL של R-RPA-RNRr, 10 μL של 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL של תבנית ה- DNA, ו- 7.4 μL של H2O.<ol><li>השתמש בתנאי התגובה הבאים של מחזור תרמי: 30 שניות ב- 95 °C; ואחריו 45 מחזורים של 5 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ו-32 שניות ב-60 מעלות צלזיוס; ואז שלב עקומת התכה של 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס ו-15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כלול שלוש חזרות טכניות בכל חזרה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את פעולת השירות CLas-DETECTR בהתאם לשלבים 1.1-1.4.</li>
</ol>3. השוואת רגישות
<ol><li>כדי לבדוק את הרגישות של CLas DETECTR, זהה סדרה של דילולים של מקטעי DNA של CLas באמצעות PCR, CLas-DETECTR ו- qPCR, כמתואר לעיל.</li>
	<li>הגבר מקטע דנ"א באורך של 1,060 bp מ- nrdB באמצעות קבוצת הפריימרים F-RNR ו- R-RNR בתערובת תגובה של 100 μL המכילה 4 μL של F-RNR, 4 μL של R-RNR, 50 μL של PrimeSTAR Max Premix, 2 μL של תבנית DNA, ו- 40 μL של H2O, בעקבות תנאי תגובת המחזור התרמי (30 שניות ב- 98 °C; ואחריו 35 מחזורים של 10 שניות ב- 98 °C, 15 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-72 מעלות צלזיוס; ואז 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס; ומחזיקים ב-16 מעלות צלזיוס). הערה: הגן nrdB (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β- תת-יחידה) הוא ספציפי ל-CLas21. ניתן להשיג בקלות את האמפליקון nrdB מ-gDNA הדרים חיובי ל-CLas באמצעות ערכת הפריימרים F-RNR ו-R-RNR. קבוצת הפריימרים F-RNR ו-R-RNR מגבירה מקטע nrdB של 1,060 bp, ואילו קבוצת הפריימרים F-RPA-RNR ו-R-RPA-RNR מגבירה מקטע של 104 bp של הגן nrdB, שהוא החלק של מקטע nrdB של 1,060 bp.</li>
	<li>טהרו את מוצרי ה-PCR עם ערכת מיצוי ג'ל DNA בהתאם למדריך היצרן.</li>
	<li>דלל את מוצרי ה-PCR המכילים את אמפליקונים nrdB עם ddH2O מעוקר.</li>
	<li>חשב את מספר ההעתקה של הגן nrdB באמצעות מספר עותק DNA מקוון זמין מסחרית ומחשבון דילול.</li>
	<li>הכן דילולי DNA המכילים 2.01 × 106 עותקים / μL, 2.01 × 105 עותקים / μL, 2.01 × 104 עותקים / μL, 2.01 × 103 עותקים / μL, 2.01 × 10 2 עותקים / μL, 2.01 × 10 1 עותקים/ μL, 2.01 × 10 0 עותקים / μL, ו-2.01 × 10−1 עותקים / μL של מקטע DNA CLas.</li>
</ol>4. זיהוי מדגם
הערה: לאחר בדיקת הספציפיות והרגישות, נעשה שימוש בשיטת CLas-DETECTR כדי לזהות נוכחות של CLas בדגימות עלי השדה שנאספו מעצי תפוז מתוקים של Newhall שגדלו במשתלת משאבי הנבטים בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות.
<ol><li>בדוק בסך הכל 15 עצים. השתמש במים כבקרה שלילית.</li>
	<li>בצע את השיטות CLas-DETECTR ו- qPCR כמתואר לעיל. הערה: בשל מאפייני ההפצה הלא אחידים של CLas בהדרים, עלים המראים תסמיני HLB נאספו כעדיפות. אם עץ נראה בריא, העלים נאספו באופן אקראיCLas-DETECTR המערכת פועלת כראוי.</li>
</ol>

<ol><li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529(2022).</li>
<li>Bové, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huanglongbing%3A+A+destructive%2C+newly-emerging%2C+century-old+disease+of+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Candidatus+Liberibacter-host+interface%3A+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li>
<li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37(2009).</li>
<li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392(2021).</li>
<li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+from+Murraya+paniculata+in+Guandong%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051(2007).</li>
<li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+detection+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+in+citrus%2C+and+identification+by+GeLC-MS%2FMS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272(2016).</li>
<li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus%2C+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Pathology+Journal%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li>
<li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+%28HLB-RPA-LFA%29+for+rapid+detection+of+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530(2018).</li>
<li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+%27Candidatus+Liberibacter+solanacearum%27+in+potatoes+and+psyllids%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li>
<li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostics+with+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711(2020).</li>
<li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568(2021).</li>
<li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV%2C+TEV%2C+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li>
<li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification%3A+Basics%2C+applications+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672(2019).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B%3A+Biological+implications+and+PCR+detection+application%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020(2016).</li>
<li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria%2C+eukaryotic+tissue+samples%2C+and+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li>
<li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963(2022).</li>
<li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+%28%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27%29+using+Cas12a-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

מחקר זה מציג שיטה מהירה וניידת לזיהוי CLas בשם CLas-DETECTR, המשלבת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a. זרימת העבודה מודגמת באיור 1. CLas-DETECTR מזהה CLas עם ספציפיות ורגישות (איור 2 ואיור 3). יתר על כן, באמצעות דגימות עלים של Newhall, CLas-DETECTR מזהה CLas באותה רגישות כמו qPCR (איור 4). יש לציין כי ניתן להמחיש את תוצאות הזיהוי ישירות באמצעות מכשיר נייד כף יד שאינו תלוי במכשירים מבוססי...

הואנגלונגבינג (HLB) היא אחת ממחלות ההדרים הבעייתיות ביותר בעולם1. HLB נגרם על-ידי החיידק המתיישב והמחזק של פלום קנדידטוס ליבריבקטר spp., כולל קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas), Ca. L. africanus, ו- Ca. L. americanus2. המין הנפוץ ביותר הקשור ל-HLB בסין ובארה"ב הוא CLas, המועבר על ידי פסילידים של הדרים אסייתיים (Diaphorina citri) או באמצעות השתלה3. לאחר שנדבקו ב-CLas, עצי הדר מפגינים ירידה בגדילה עד מוות2. התסמינים השכיחים של עלי הדר הנגועים ב-CLas הם כתמים עזים, איים ירוקים (נקודות ירוקות כהות עגולות קטנות), ורידים מורמים על עלים עבים ועוריים יותר, ויורה מצהיבים לא אחידים2. בנוסף, פירות נגועים CLas נראים קטנים lopsided2.
מכיוון שאף זן הדרים אינו עמיד בפני HLB ואין תרופה טיפולית ל-HLB, מניעת HLB דורשת הסגר ובידוד של עצי הדר חיוביים ל-CLas 2,3. לכן, גילוי מוקדם הוא קריטי לניטור והסגר כדי למנוע את התפשטות CLas ולמזער הפסדים כלכליים3. בנוסף, יש צורך בזיהוי CLas רגיש בשל טיטר נמוך של CLas בצמחים בשלב המוקדם של ההדבקה3. בסין, זיהוי CLas מתבצע בדרך כלל על ידי מרכזי בדיקה מוסמכים מסוימים. עם זאת, תהליך האיתור אורך בדרך כלל לפחות שבוע אחד, ודמי האיתור יקרים. לכן, כדי לסייע במעקב אחר שכיחות ה-HLB
טכנולוגיות שונות יושמו כדי לאבחן HLB 4,5,6,7,8,9. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ו-PCR כמותי (qPCR) הם הכלים הנפוצים ביותר לזיהוי CLas בשל הרגישות והספציפיות הגבוהה שלהם 4,5. עם זאת, טכנולוגיות אלה מסתמכות במידה רבה על מכשירים יקרים וכוח אדם מיומן ביותר. בנוסף, מספר שיטות הגברה איזותרמיות, כגון הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP), פותחו כחלופות אטרקטיביות לשיטות PCR קונבנציונליות בשל פשטותן, מהירותן ועלותן הנמוכה 8,9,10. עם זאת, מאתגר ליישם אותם כדי לזהות במדויק CLas בשל אותות ההגברה הלא ספציפיים, שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות.
קריספר/Cas מונחה RNA (אשכולות קבועים בין פלינדרומיים קצרים חוזרים / הקשורים לקריספר) זיהוי חומצות גרעין מבוססות אנדונוקלאז פותח כטכנולוגיית אבחון מולקולרית מהדור הבא הודות לרגישות, הספציפיות והאמינות הגבוהה שלה 11,12,13,14. טכנולוגיות אבחון אלה של CRISPR/Cas מסתמכות על פעילות הנוקלאז הבטוחה של חלבוני Cas כדי לבקע דנ"א חד-גדילי (ssDNA) ששונה באמצעות כתב פלואורסצנטי ומתקן פלואורסצנטי בכל קצה של האוליגונוקלאוטידים, כמו גם מכשיר לזיהוי פלואורסצנטי כדי ללכוד את המדווח הפלואורסצנטיהמשוחרר 11,12 . פעילות הנוקלאז של מספר אפקטים של Cas המופעלים על-ידי דופלקס המטרה של CRISPR RNA (crRNA) יכולה לבקע ללא הבחנה את ה-ssDNA11 שאינו מטרה. CRISPR-Cas12a (נקרא גם Cpf 1), מערכת V-A CRISPR/CAS מסוג 2, מדגים מספר יתרונות בהשוואה ל-Cas9, כגון סובלנות נמוכה יותר לאי-התאמה וספציפיות גבוהה יותר13. מערכת Cas12a/crRNA יושמה לזיהוי רגיש וספציפי של חומצות גרעין של פתוגנים אנושיים ופיטופתוגנים 14,15,16,17,18. לכן, שימוש במערכת Cas12a/crRNA אמור לאפשר זיהוי מדויק ורגיש של חומצת הגרעין של CLas.
Cas12a לבדו אינו רגיש מספיק מבחינה תיאורטית כדי לזהות רמות נמוכות של חומצות גרעין. לכן, כדי לשפר את רגישות הגילוי שלו, זיהוי CRISPR-Cas12a משולב בדרך כלל עם שלב הגברה איזותרמי14,15. הגברת רקומבינאז פולימראז (RPA) מאפשרת הגברה של DNA איזותרמי רגיש ומהיר בטווח טמפרטורות שבין 37 °C ל-42 °C19.
פלטפורמת זיהוי בשם DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) המשלבת את פעילות ה- DNase של Cas12a עם RPA וקריאת פלואורסצנציה פותחהלאחרונה 12 והוכחה כמזהה חומצת גרעין עם רגישות גבוהה יותר20. יתר על כן, ניתן לצפות באות הפלואורסצנטי הנפלט מהדגימות החיוביות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.
מאחר שהגברנו את הדנ"א באמצעות RPA, תכננו crRNA המכוון לגן nrdB בעל חמישה עותקים (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β- תת-יחידה) הספציפי ל-CLas21, והשתמשנו בפעילות ה-DNase של חלבון Cas12a, קראנו לשיטת זיהוי CLas זו CLas-DETECTR. בהשוואה לשיטות זיהוי CLas קיימות, CLas-DETECTR הוא מהיר, מדויק, רגיש וניתן לפריסה.

<table><tbody><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל DNA AxyPrep</td><td>קורנינג</td><td>09319KE1</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי DNA גנומי חיידקי</td><td>בסין Solarbio</td><td>D1600</td><td>סין</td></tr><tr><td>EnGen LbCas12a&nbsp;</td><td>TOLOBIO</td><td>32104-01</td><td>סין</td></tr><tr><td>Ex Taq גרסה 2.0 פלוס צבע</td><td>TaKaRa</td><td>RR902A</td><td>סין</td></tr><tr><td>מכשיר לזיהוי פלורסנט כף יד&nbsp;</td><td>LUYOR</td><td>3415RG</td><td></td></tr><tr><td>מנקב חורים בסין&nbsp;</td><td>מעדנייה</td><td>114</td><td>סין</td></tr><tr><td>מגנזיום אצטט, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>בריטניה</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SCR</td><td>10019718</td><td>סין</td></tr><tr><td>NEB buffer 3.1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7203</td><td>ארה"ב</td></tr><tr><td>צינורות רצועת PCR</td><td>LABSELECT</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>סין</td></tr><tr><td>PEG 200&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3015</td><td>ארה"ב</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA פולימרים</td><td>TaKaRa</td><td>R045A</td><td>סין</td></tr><tr><td>טעינה מהירה סגול 1 kb פלוס סולם DNA&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0550S</td><td>ארה"ב</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td> <td>TaKaRa</td><td>RR820B</td><td>סין</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>בריטניה</td></tr></tbody></table>

זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם crispr-cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

הגילוי המוקדם של קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas) על ידי מגדלי הדרים מקל על התערבות מוקדמת ומונע את התפשטות המחלה. כאן מוצגת שיטה פשוטה לאבחון מהיר ונייד של הואנגלונגבינג (HLB) המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז וכתב פלואורסצנטי המנצל את פעילות הנוקלאז של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצים באופן קבוע/מערכת 12a (CRISPR-Cas12a) הקשורה לקריספר. הרגישות של טכניקה זו היא הרבה יותר גבוהה מאשר PCR. יתר על כן, שיטה זו הראתה תוצאות דומות ל- qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות עלים. בהשוואה לשיטות גילוי CLas קונבנציונליות, ניתן להשלים את שיטת האיתור המוצגת כאן תוך 90 דקות ועובדת במצב איזותרמי שאינו דורש שימוש במכונות PCR. בנוסף, ניתן להמחיש את התוצאות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.

כאן תיארנו פלטפורמה ניידת, CLas-DETECTR, המסרקת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a כדי לאבחן HLB בשטח. הסכימה של CLas-DETECTR מודגמת באיור 1A.
כאשר דגימות עלים מעצי ניוהול הנגועים ב-HLB ומעצי ניוהול שאינם נגועים ב-HLB (איור 1B), שעבורם נוכחות ה-CLas אושרה על-ידי PCR (איור 1C), היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR, אות פלואורסצנטי ירוק נצפה בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בדגימה הלא נגועה ב-HLB ובבקרה השלילית (איור 1D).</strong...

בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.

זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

הואנג בינג ארוך, מקוצר כמו HLB. זו מחלת הדרים הרסנית ברחבי העולם. במדינות המייצרות ביותר הדרים, כמו סין וארה"ב, HLB נגרם על ידי החיידק המוגבל בפלואם Candidatus Liberibacter asiaticus, המכונה בקיצור CLas.גילוי מוקדם של CLas היה חשוב למגדלים כדי להקל על התערבות מוקדמת ולמנוע התפשטות מחלות. אז כאן פיתחנו שיטה חדשה לאבחון HLB מהיר ונייד, בשילוב עם הגברה של רקומבינאז פולימראז ומערכת CRISPR-Cas12a. קראנו לזה CLas-DETECTR.הרגישות של הפלטפורמה שלנו גבוהה בהרבה מ- PCR. יתר על כן, הוא מראה תוצאה דומה עם qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות העלים. בהשוואה לגילויי CLas הקונבנציונליים, ניתן לסיים את השיטה שלנו תוך 90 דקות, והיא עובדת במצב איזותרמי.ניתן גם לדמיין את התוצאה באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח. ה- CLas-DETECTR מכיל ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א ותוצאות הדמיה. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת כאן.מאגר A, פתרון B ופתרון C מוכנים כמתואר בפרוטוקול. כדי לחסוך זמן ולהפוך שיטה זו למתאימה לזיהוי CLas בשדה, הגישה המבוססת על פוליאתילן גליקול E.coli שימשה להשגת תמציות צמחים גולמיות להגברת DNA. עלי הדרים משמשים בכלי.מנקבים את החתיכות המעטות של דיסקיות העלה מהעלה. שים דיסקיות עלים לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ A לתוך הצינור.טוחנים את דיסקיות העלים עד לקבלת מרקם חלק בעזרת מוט פלסטיק ידני. השאירו את הצינור ללא הפרעה למשך 10 דקות. הסופר-נטנט מוחל לאחר מכן על הגברה של הדנ"א.להגברת DNA איזותרמית, הוסיפו מיקרוליטר אחד של סופרנטנט משלב 2.3 ומיקרוליטר אחד של מגנזיום אצטט לתמיסה B וערבבו היטב. במעבדה, לדגור אותם באינקובטור פשוט ב 37 מעלות במשך 15 דקות. כדי להמחיש את התוצאות, הוסיפו 10 מיקרוליטר של התערובת משלב 3.2 לתמיסה C וערבבו היטב.לדגור אותם בחממה 37 מעלות במשך 60 דקות. הרכיבו משקפי מגן, והתבוננו באות הפלואורסצנטי הירוק באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני. כדי לבחון את הספציפיות של CLas-DETECTR, המושבות הטהורות הראשונות של אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri שהוא הפתוגן של קנקן ההדרים וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודדו במעבדה שלנו שימשו לחילוץ הדנ"א הגנומי שלהם. לאחר מכן, הדנ"א הגנומי של שלושת החיידקים והדנ"א הגנומי של ניוהול חיובי ל-CLas, היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR. כדי לבחון את הרגישות של CLas-DETECTR, זוהתה סדרה של דילולים של מקטעי דנ"א של CLas באמצעות PCR, CLas-DETECTR ו- qPCR כמתואר בפרוטוקול לאחר בדיקת הספציפיות והרגישות, נעשה שימוש בשיטת CLas-DETECTR כדי לזהות את נוכחות ה- CLas בשדה.דגימות עלים שנאספו מעץ תפוז מתוק של ניוהול שגדלו במשתלת משאבי הנבטים בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. qPCR, שיטת זיהוי CLas משכנעת המשמשת בדרך כלל במעבדה יושמה גם היא. דגימות העלים מעץ ניוהול הנגוע ב-HLB ומעץ ניוהול שאינו נגוע ב-HLB, שבו אושרה נוכחות ה-CLas במעבדה שלנו, היו נתונות לבדיקת CLas-DETECTR.אות הפלואורסצנציה הירוק נלכד בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בבקרה הלא נגועה והשלילית של HLB. קבענו את הספציפיות של CLas-DETECTR באמצעות חומצות גרעין המופקות מחיידקים אחרים. בבדיקת CLas-DETECTR, רק gDNA שחולץ מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas הדגים אותות פלואורסצנטיים ירוקים.gDNA המופק מ- Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ו- Burkholderia stabilis זן 1440 לא, מה שאומר ש- CLas-DETECTR יכול לזהות CLas באופן ספציפי. בדקנו גם את הרגישות של CLas-DETECTR באמצעות סדרה של דילולי דנ"א CLas, המפורטים בפרוטוקול.PCR יכול לזהות 201 עותקים למגה-ליטר. מצד שני, CLas-DETECTR יכול לזהות 2.01 עותקים למגה-ליטר, מה שמרמז על זמינותו כאבחון שדה רגיש. qPCR יכול לזהות 0.201 עותקים למגה-ליטר וערך ה-Ct גבוה מ-36.אז CLas-DETECTR הוא שני סדרי גודל רגישים יותר מאשר PCR מסורתי וסדר גודל אחד פחות רגיש מאשר qPCR כאשר נעשה שימוש באמפליקונים ספציפיים של CLas מדולל. לבסוף, בחן מחדש את ההיתכנות של CLas-DETECTR לדגימות שדה, והשווה את רגישותו ל- qPCR. במספרים, אנו רואים.אנו יכולים לראות כי ערך Ct גבוה מ 36 כאשר ריכוז CLas הוא פחות מ 0.2 עותקים למגה ליטר, שהוא ריכוז נמוך מאוד. מבין 15 הדגימות, ערך ה-Ct של הדגימות 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ו-14 שזוהו על ידי qPCR היה פחות מ-36. נצפתה לכאורה אותות פלואורסצנטיים ירוקים.מצד שני, כאשר ערך ה- Ct של הדגימות 6, 7, 9, 12 ו- 15 שזוהו על ידי qPCR לא נקבע, לא נצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים. בנוסף, אותות פלואורסצנטיים ירוקים חלשים נצפו כאשר ערך ה- CT של מדגם 5 ו - 11 שזוהה על ידי qPCR היה גבוה מ -36. התוצאות יצביעו על כך שהפלטפורמה שלנו היא כלי מהיר, חזק ורגיש לאבחון HLB בתחום.

field-deployable-candidatus-liberibacter-asiaticus-detection-using

Research

JoVE Journal

Biology

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

אבחון מבוסס קריספר נקודתי עם ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה

כדי להקל על הזיהוי המהיר והמדויק של Acinetobacter baumannii, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהגברה רקומבינאז פולימראז (RPA) בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a לזיהוי זיהומי A. baumannii .

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מבוססת Cas12a

בפרוטוקול זה, מבחן CRISPR/Cas12a משולב להגברת פולימראז רקומבינאז מודגם לזיהוי הפתוגן הצמחי הפולש, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4.

בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

כאן, אנו מתארים הליך פשוט ומהיר לזיהוי DNA מפתוגנים של דבורים, כגון Lotmaria passim ו-Nosema ceranae, באמצעות ליזיס תאים מוכן להגברה, הגברת פולימראז רקומבינאז ומבחני CRISPR/Cas12a.

זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a

וידאו זה מציג טכניקות תיוג של אדם בתאי גזע עובריים ותאי גזע mesenchymal עם צבעי ניאון. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo מעקב בתאי גזע המושתלים עם הדמיה אופטית עבור מתאמים histopathological עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

הופעתו של אתר ספציפי טכנולוגיה recombinase (SSR) ומערכת Cre / לקס הובילה להתקדמות רבים בתחום הביולוגיה המולקולרית, וכן הוכיחה את עצמה ככלי רב ערך להערכת תפקוד גן חיות טרנסגניות. בראיון זה מתאר את מנגנון רקומבינציה אתר ספציפי על ידי Cyclization recombinase (Cre) וכיצד להשתמש אנזים זה הוביל לפיתוח של mutagenesis מותנה, אשר יש יתרונות משמעותיים על פני המסורתיים לדפוק את אסטרטגיות.

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים. אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים אישית שישמש כלי הניתוח המולקולרי ורפואה מולקולרית.

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

נוכחי HIV-1 אסטרטגיות לפעול כדי לדכא את מחזור החיים של נגיפי אבל לא יעיל למיגור זיהום. כאן, אנו מראים כי recombinase מהונדסים יכולים הבלו ביעילות משולב DNA HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

למדו שיטת CLas-DETECTR לזיהוי מהיר של Candidatus Liberibacter asiaticus בצמחי הדרים בשטח. השיטה משלבת הגברת רקומבינאז פולימראז עם CRISPR-Cas12a ומספקת תוצאות תוך 90 דקות בלבד.

זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a

גלה סרטונים נוספים