JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 2:58 min. • August 29th, 2025
Inizia con una coltura aderente di cellule progenitrici neuronali derivate da cellule staminali preparate per la differenziazione in neuroni corticali.
Rimuovere il terreno, quindi aggiungere un enzima per interrompere la matrice extracellulare e staccare le cellule.
Utilizzare un inibitore per neutralizzare l'enzima, quindi aggiungere un terreno fresco.
Trasferire la sospensione in una provetta, centrifugare e scartare il surnatante per isolare le cellule.
Risospendere le cellule in una matrice di membrana basale per facilitare il trapianto nel tessuto cerebrale, quindi caricarle in un tubo capillare freddo.
Prendi una fetta corticale umana su un gruppo transwell contenente un mezzo.
Rimuovere parte del terreno, quindi iniettare goccioline della sospensione cellulare nel tessuto.
Incubare per consentire alla matrice di solidificarsi.
Aggiungere un terreno per immergere il tessuto, quindi incubare per consentire alle cellule progenitrici di differenziarsi in neuroni, estendere i loro neuriti e formare sinapsi con i neuroni corticali ospiti.
La fetta corticale è ora pronta per l'analisi.
Rimuovere il terreno dal pallone per colture cellulari. Il settimo giorno di differenziazione, staccare le cellule GFP-lt-NES innescate corticamente aggiungendo 500 microlitri di tripsina e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina seguito da cinque millilitri di terreno DDM. Risospendere le cellule, trasferire delicatamente la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 300 G. Nel frattempo, trasferire la piastra contenente il tessuto umano dall'incubatrice alla cappa e rimuovere due millilitri di terreno dalla parte superiore dell'inserto. Al termine della centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in una matrice di membrana basale fredda e pura e trasferire la sospensione in una provetta più piccola.
Raccogliere la sospensione cellulare in un capillare di vetro freddo collegato a una tettarella di gomma per l'aspirazione. Iniettare la sospensione cellulare sotto forma di minuscole gocce pugnalando la fetta di tessuto semisecco in vari siti. Lasciare solidificare il gel a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, trasferire la piastra dall'incubatrice alla cappa e aggiungere con cura due millilitri di terreno corticale umano adulto alla parte superiore dell'inserto per immergere completamente il tessuto.