Visualizzazione mediata da nanoparticelle del rimodellamento endolisosomiale in cellule infettate da batteri

Prendere un vetrino a camera contenente cellule epiteliali umane con endosomi marcati in fluorescenza.

Introdurre batteri patogeni intracellulari e incubarli, permettendo loro di aderire alle cellule.

I batteri iniettano proteine che riorganizzano il citoscheletro dell'ospite, formando sporgenze di membrana che internalizzano i batteri in vacuoli.

Questi vacuoli estendono proiezioni tubulari che si collegano al sistema endo-lisosomiale, una rete di vescicole e organelli che regolano il traffico intracellulare.

Queste proiezioni reindirizzano il trasporto delle vescicole e rimodellano il sistema endo-lisosomiale.

Lavare per rimuovere i batteri extracellulari, quindi incubare con un mezzo contenente antibiotici per eliminare eventuali batteri rimanenti.

Sostituire con un mezzo di imaging privo di siero contenente l'antibiotico e aggiungere nanoparticelle marcate con un fluoroforo contrastante.

Incubare per consentire l'ingresso di nanoparticelle attraverso l'endocitosi e l'accumulo nelle vescicole rimodellate.

Lavare per rimuovere le nanoparticelle non internalizzate, quindi incubare in un mezzo di imaging integrato con siero.

Le nanoparticelle fluorescenti e gli endosomi marcati consentono la visualizzazione del rimodellamento endolisosomiale indotto dai batteri.

Per iniziare questa procedura, misurare l'OD 600 dei batteri in subcoltura e diluire a un OD 600 di 0,2 in un millilitro di PBS, aggiungere quantità appropriate di batteri alle cellule HeLa nel vetrino della camera a 8 pozzetti per ottenere una molteplicità di infezione di 100. Incubare per 30 minuti nell'incubatore cellulare.

Lavare le cellule HeLa tre volte con PBS per rimuovere i batteri non internalizzati. Questo punto temporale è impostato come zero ora dopo l'infezione o zero ora p.i. Aggiungere alle cellule 300 microlitri di terreno di coltura fresco contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina e mantenere per un'ora.

Dopo un'ora, sostituire il terreno con un terreno di imaging contenente 10 microgrammi per millilitro di gentamicina. Aggiungere NP di oro-BSA-rodamina alle cellule HeLa per ottenere una concentrazione finale di OD 520 di 0,1.

Incubare per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere il mezzo e lavare tre volte con PBS. Infine, aggiungere 300 microlitri di terreno di imaging fresco contenente il 10% di FCS e 10 microgrammi per millilitro di gentamicina per il resto del tempo di incubazione.