JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 2:39 min. • September 26th, 2025
Inizia con embrioni di zebrafish anestetizzati iniettati con batteri patogeni marcati in fluorescenza, da soli o mescolati con microsfere di biomateriali, per modellare l'infezione associata al biomateriale in vivo.
Posizionare una piastra di Petri contenente terreno basale con anestetico sul tavolino di un microscopio a stereofluorescenza dotato di filtri appropriati.
Aggiungere la soluzione di metilcellulosa al piatto per creare un mezzo viscoso che immobilizza gli embrioni per l'imaging.
Trasferisci i singoli embrioni nella metilcellulosa e allineali orizzontalmente, assicurandoti che il sito di iniezione sia visibile.
Utilizzando il filtro a campo chiaro, concentrarsi sul sito di iniezione per individuare la regione infetta.
Imposta i parametri di imaging Z-stack e acquisisci immagini a fluorescenza a diverse profondità per catturare le dinamiche dell'infezione in tre dimensioni.
Utilizzando il software, è possibile analizzare le immagini acquisite nel tempo per quantificare l'intensità della fluorescenza e monitorare la distribuzione batterica.
Questo protocollo consente un confronto diretto della progressione dell'infezione in embrioni vivi con e senza esposizione al biomateriale.
Posizionare una piastra di Petri da 100 millimetri contenente terreno E3 integrato con tricaina allo 0,02% su un tavolino per microscopio a stereofluorescenza e aggiungere 500 microlitri di metilcellulosa al 2% nella piastra di Petri. Per monitorare l'andamento dell'infezione mediante microscopia a fluorescenza, equipaggiare gli appropriati filtri a campo chiaro e fluorescenti, allineare gli embrioni infetti anestetizzati orizzontalmente in un punto di metilcellulosa in una capsula di Petri.
Usa il filtro a campo chiaro per mettere a fuoco il tessuto iniettato danneggiato con un ingrandimento di 160x. Impostare la profondità Z-stack a 10 micrometri e la dimensione del passo a cinque micrometri per consentire la registrazione di tre immagini consecutive. Quindi visualizza i singoli embrioni con impostazioni ottimizzate identiche con un ingrandimento di 160x.
Utilizzare il plug-in ObjectJ in ImageJ per analizzare le immagini.