JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
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Prendi una coltura di S. aureus sensibile all'antibiotico cloramfenicolo.
Centrifugare per pellettare i batteri e rimuovere il surnatante.
Trasferire il pellet in una provetta contenente mezzi di limitazione dei nutrienti e incubare. Lo stress nutrizionale migliora la competenza, la capacità del batterio di internalizzare il DNA estraneo.
Centrifugare nuovamente e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in un terreno fresco che limita i nutrienti.
Successivamente, aggiungi il DNA estratto da un ceppo di S. aureus che trasporta un gene resistente al cloramfenicolo. Incubare.
Il macchinario di assorbimento del DNA elabora il DNA in un singolo filamento e lo trasloca nel citoplasma, dove si integra nel cromosoma batterico.
Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in un mezzo ricco di sostanze nutritive.
Trasferire la sospensione in agar fuso ricco di sostanze nutritive contenente cloramfenicolo.
Versare il composto in un piatto e incubare.
La crescita di colonie resistenti al cloramfenicolo indica un assorbimento riuscito del DNA.
Coltivare la cellula ricevente durante la notte, in cinque millilitri di TSB a 37 gradi Celsius con agitazione. La mattina seguente, trasferire 0,5 millilitri di coltura notturna in una provetta da 1,5 millilitri.
Precipitare le cellule per centrifugazione. Quindi sospendere le cellule con 10 millilitri di terreno CS2 in una provetta da 50 millilitri. Successivamente, far crescere i batteri a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 rotazioni al minuto per otto ore fino alla fase esponenziale tardiva.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno CS2 fresco. Aggiungere 10 microgrammi di plasmide purificato o DNA genomico alla sospensione cellulare.
Agitare la coltura a 180 rotazioni al minuto. Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno BHI.
Mescolare la sospensione cellulare con 90 millilitri di integratore di agar BHI fuso con 32 milligrammi per litro di cloramfenicolo e cinque microgrammi per litro di tetraciclina nell'esperimento di controllo. Versare il composto nelle piastre di Petri da 90 millimetri e raffreddare rapidamente e lasciare solidificare l'agar. Replicare le colonie utilizzando stuzzicadenti su piastre contenenti antibiotici appropriati per confermare le loro caratteristiche di resistenza.