JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 2:15 min. • October 30th, 2025
Prendi come riferimento un vetrino contenente spore batteriche dormienti e microsfere fluorescenti.
Le spore trasportano reporter fluorescenti rossi e verdi per le proteine della germinazione, con la membrana interna colorata con un colorante lipofilo.
Montare il vetrino su un microscopio a illuminazione strutturata o SIM dotato di un obiettivo a immersione in olio.
Individua le microsfere fluorescenti e regola la messa a fuoco per ridurre al minimo la sfocatura dell'immagine.
Successivamente, utilizzare la luce trasmessa per individuare le spore batteriche.
Passa alla modalità SIM e illumina le spore per eccitare i fluorofori.
Acquisisci immagini a fluorescenza ad alta risoluzione in tutta la profondità delle spore.
Sulla membrana interna lipofila colorata con colorante, le proteine di germinazione appaiono come focolai distinti di rosso e verde. Ciò consente di mappare con precisione la posizione delle proteine di germinazione all'interno delle spore batteriche.
Per l'imaging dei campioni, posizionare il vetrino su un microscopio a illuminazione strutturata dotato di un obiettivo a olio 100X e mettere a fuoco le microsfere fluorescenti da 100 nanometri.
Regolare l'anello di correzione sull'obiettivo 100X fino a ottenere una funzione di diffusione del punto simmetrico per ridurre al minimo la sfocatura delle immagini e selezionare un campo visivo con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una regolazione della messa a fuoco del reticolo per le lunghezze d'onda di eccitazione designate, in questo caso 561 e 488 nanometri, come guida per il software di analisi delle immagini prima di mettere a fuoco le spore con la luce di trasmissione. Cattura un'immagine a luce di trasmissione in modalità media 16X con esposizioni di 20 millisecondi per ogni immagine.
Quindi, acquisisci immagini fluorescenti grezze delle spore con il microscopio a illuminazione strutturata 3D.