Purificazione delle proteine del dominio P ricombinante derivate da batteri del norovirus umano

Prendere una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale confezionata con perle di gel sferiche porose.

Equilibrare la colonna con un tampone che preservi l'integrità strutturale delle proteine durante la separazione.

Caricare un estratto batterico purificato contenente proteine del dominio P del norovirus umano espresse in modo ricombinante e impurità proteiche residue.

Aggiungere il buffer per guidare il campione attraverso la colonna.

Le grandi impurità residue non possono entrare nei pori e passare attraverso gli spazi tra le perle, eluendo per prime.

Monitorare l'eluizione utilizzando l'assorbanza UV. Un piccolo picco indica le impurità che escono dalla colonna.

Al contrario, le piccole proteine del dominio P entrano nei pori della perlina, percorrono un percorso più lungo ed eluiscono in seguito. Un aumento del picco di assorbanza indica l'eluizione delle proteine del dominio P.

Raccogliere le frazioni eluite contenenti le proteine del dominio P, che sono ora pronte per ulteriori analisi.

Lavare le pompe e le tubazioni del sistema di purificazione per cromatografia liquida ad alte prestazioni e pre-equilibrare la colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale con tampone di filtrazione su gel. Iniettare il dominio P sulla colonna a una velocità di flusso di un millilitro al minuto, utilizzando un superloop o loop, a seconda del volume del campione concentrato. Al termine dell'iniezione, aumentare la portata a 2,5 millilitri al minuto.

All'aumentare della densità ottica e al distacco del dominio P dalla colonna, raccogliere frazioni di 1,5 millilitri. Il dominio P è solitamente eluito come dimero.