JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 2:07 min. • October 30th, 2025
Prelevare campioni separati di cellule vive e morte di Microcystis aeruginosa .
Mescolare i campioni per creare una popolazione combinata.
La microcystis contiene ficocianina, un pigmento autofluorescente che rimane intatto nelle cellule vive ma si degrada nelle cellule morte.
Agitare il campione per rompere i grumi e generare una sospensione uniforme a cellula singola.
Aggiungere una sonda fluorescente impermeabile alla membrana cellulare e legante l'acido nucleico e incubare il campione al buio per evitare il fotosbiancamento.
La sonda entra selettivamente nelle cellule morte attraverso le loro membrane danneggiate e si lega al DNA intracellulare.
Far passare il campione attraverso un citometro a flusso per misurare l'autofluorescenza della ficocianina e la fluorescenza della sonda dell'acido nucleico utilizzando laser a lunghezza d'onda di eccitazione appropriati.
Le cellule vive emettono una forte autofluorescenza della ficocianina ma non mostrano alcun segnale della sonda.
Al contrario, le cellule morte mostrano una ridotta emissione di pigmento e un'elevata fluorescenza della sonda, confermando il danno alla membrana.
Ciò consente l'identificazione delle cellule vive ricche di pigmenti dalle cellule morte.
Per ottimizzare l'assorbimento delle cellule della sonda molecolare, esporre metà della monocoltura precedentemente preparata alle condizioni appropriate per generare un controllo morto. Controllare le variazioni nel microambiente campione per confermare la morte della coltura. E poi disaggregare la formazione della colonia come appena dimostrato.
Quindi, seleziona un laser a 488 nanometri insieme a un rivelatore in grado di registrare la fluorescenza dalle sonde di acido nucleico verde e arancione. E il laser a 640 nanometri per registrare i segnali di ficocianina attraverso i rispettivi rivelatori.