JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
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Inizia con una piastra di agar ricca di sostanze nutritive integrata con tiosolfato.
Striare i cianobatteri e incubare alternando periodi di luce e buio per mantenere il ciclo circadiano.
Durante il periodo di luce, l'assorbimento dei nutrienti e il tiosolfato supportano la crescita batterica e la condensazione del DNA.
Nel periodo di buio, le cellule conservano energia e si dividono.
Il ciclo alternato luce-buio sincronizza le cellule allo stesso stadio di crescita e divisione.
Dopo il periodo di luce, aggiungere una soluzione di saccarosio e pipettare ripetutamente per rilasciare cianobatteri, provocando un cambiamento di colore. Trasferire le cellule in una provetta.
Aggiungere un colorante fluorescente specifico per il DNA e incubare al buio. Il colorante si lega al DNA cianobatterico.
Centrifugare per separare i cianobatteri e rimuovere il surnatante.
Risospendere i cianobatteri in una soluzione di saccarosio, trasferire la sospensione su un vetrino e coprirla.
Al microscopio a fluorescenza, il DNA condensato blu nelle cellule conferma la progressione sincronizzata e regolata circadiana del ciclo cellulare cianobatterico.
Inizia con la crescita dei cianobatteri su piastre BG-11 sterilizzate di nove centimetri contenenti l'1,5% di agar e lo 0,3% di tiosolfato di sodio. Incubare le piastre a 23 gradi Celsius con un ciclo di luce 12-12 con 50 micro-E di luce per metro quadrato al secondo. Per mantenere le cellule, trasferirle settimanalmente su piastre di agar BG-11 fresche.
Entro una settimana, le colture appaiono come bande verdi. Trasferire i grumi verdi di cellule utilizzando un anello sterilizzato a fiamma e strisciarli sulla nuova piastra. Per osservare la compattazione del DNA, raccogliere le cellule coltivate per sei giorni al termine del periodo di luce.
Per rilasciare le cellule dalla piastra, aggiungere un millilitro di saccarosio 0,2 molari. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e ripetere l'aggiunta e la rimozione del saccarosio fino a quando la soluzione diventa verde. Il cambiamento di colore indica che la maggior parte delle celle è stata rilasciata.
Ora, trasferire 500 microlitri di soluzione di cellule sospese in una provetta Microfuge e aggiungere il colorante Hoechst per una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Quindi, lasciare incubare le cellule al buio per 10 minuti. Quindi, centrifugare le cellule, scartare il surnatante e risospenderle in 10 microlitri di saccarosio 0,2 molari.
Quindi, trasferire un microlitro di sospensione su un vetrino, applicare un vetrino coprioggetti e osservare le cellule al microscopio a fluorescenza dotato di filtro UV. Utilizzando un obiettivo a immersione in olio 100 volte, cerca prove di compattazione del DNA, che dovrebbero essere osservabili nella maggior parte delle cellule.