JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 4:46 min. • September 26th, 2025
Prendiamo un sistema batterico privo di cellule che manca di strutture cellulari intatte ma conserva i componenti molecolari necessari per la trascrizione e la traduzione in vitro .
Introdurre plasmidi che codificano l'antigene della proteina di membrana e la proteina dell'impalcatura, insieme a fosfolipidi e polimeri sintetici.
Integrare la miscela con ATP, GTP e un mix di aminoacidi per avviare la sintesi proteica.
Contemporaneamente, preparare una soluzione alimentare arricchita con la miscela di aminoacidi.
Caricare la miscela nella camera interna e la soluzione di alimentazione nella camera esterna di un dispositivo di dialisi a doppio scompartimento.
Durante l'incubazione, i substrati si diffondono dalla camera esterna a quella interna attraverso la membrana semipermeabile, facilitando la trascrizione plasmidica e la traduzione proteica.
La proteina scaffold assembla i fosfolipidi e i polimeri in nanodischi lipidici e facilita il ripiegamento e l'incorporazione dell'MPA in queste strutture.
I sottoprodotti generati durante la reazione si diffondono nella camera esterna, mantenendo le condizioni ottimali per la formazione di MPA stabilizzato con nanodischi.
Preparare i MOMP-tNLP utilizzando un metodo cell-free.
Scongelare il tampone di ricostituzione dal kit di espressione proteica libera da cellule due ore prima di impostare la reazione e aggiungere l'inibitore della proteasi senza EDTA al tampone. Utilizzare un kit progettato per eseguire cinque reazioni da un millilitro. Per ogni reazione di un millilitro, aggiungere 525 microlitri di tampone di ricostituzione al flacone di lisato di E.coli e arrotolarlo per scioglierlo.
Aggiungere 250 microlitri di tampone di ricostituzione al flacone di reazione contenente l'additivo e sciogliere arrotolando. Quindi, aggiungere 8,1 millilitri di tampone di ricostituzione al flacone di alimentazione di reazione e arrotolarlo per scioglierlo. A una bottiglia di miscela di aminoacidi, aggiungere tre millilitri di tampone di ricostituzione per scioglierlo.
A un'altra bottiglia di metionina, aggiungere 1,8 millilitri di tampone di ricostituzione, scioglierlo e conservarlo in ghiaccio. Aggiungere 225 microlitri della miscela ricostituita, 270 microlitri della miscela di aminoacidi ricostituiti senza metionina e 30 microlitri di metionina ricostituita al flacone di lisato di E.coli . Inoltre, aggiungere 400 microlitri della miscela DMPC/telodendrimero, 15 microgrammi di plasmide MOMP e 0,6 microgrammi di delta-49 ApoA1 alla miscela e mescolare.
Aliquotare 20 microlitri della soluzione totale in una provetta da 1,5 millilitri Per una reazione di controllo che esprime GFP. Preparare una soluzione alimentare aggiungendo 2,65 millilitri della miscela di aminoacidi ricostituiti senza metionina e 300 microlitri di metionina ricostituita. Trasferire un millilitro della soluzione di reazione nella camera di reazione interna del kit di reazione senza celle e sigillarla.
Riempire la camera esterna del recipiente di reazione con 10 millilitri di soluzione alimentare e chiuderla. Aggiungere 0,5 microlitri del plasmide di controllo GFP alle aliquote da 20 microlitri della miscela di reazione. Mettere la reazione in uno shaker a 300 rotazioni al minuto per 18 ore a 30 gradi Celsius.
Monitorare la reazione sotto una luce UV dopo 15 minuti per la fluorescenza dovuta alla sintesi di GFP.