JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 3:17 min. • November 28th, 2025
Inizia con un agar morbido fuso mantenuto a temperatura calda.
Inoculare una coltura di Pseudomonas syringae , il ceppo test, nell'agar.
Poi vortice brevemente per distribuire le cellule in modo uniforme.
Versa il composto su una piastra di agar solidificata e spargila uniformemente.
Chiudi il coperchio e lascia che si solidifichi.
Individua un soprandanante filtrato sulla superficie dell'agar solidificato.
Il soprantantante contiene batteriocina, una molecola antibatterica derivata da un ceppo di donatore indotto dallo stress , P. syringae .
Incubare la piastra per permettere la crescita batterica e la diffusione della batteriocina attraverso l'agar.
La batteriocina si lega a specifici recettori superficiali del ceppo di prova e ne interrompe la membrana, causando la morte cellulare.
Questo porta alla formazione di una zona libera sull'agar, che indica l'area in cui il ceppo di prova è stato ucciso dalla molecola antibatterica batteriocina.
Diluire la coltura da 1 a 100 in KB freschi. Incubare la coltura per tre o quattro ore agitandola a temperatura ambiente. Successivamente, prepara agar acquoso sterilizzato autoclavando una sospensione di agar in acqua ultra-pura.
Mantieni l'agar morbido fuso in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius prima dell'uso. Utilizzando una pipetta sierologica sterile, trasferire tre millilitri di agar morbido in un tubo di coltura sterile. Riporta il tubo di coltura nel bagno d'acqua per mantenerlo in uno stato fuso.
Prima di versare la copertura, lascia raffreddare l'agar fuso, ma non lasciarlo solidificare.
È fondamentale che l'agar sia mantenuto in uno stato caldo e completamente fuso prima dell'inoculazione. Altrimenti, la sovrapposizione avrà un aspetto granuloso e sarà più difficile da interpretare.
In un cappuccio sterile, inoculare 100 microlitri della coltura del ceppo tester nell'agar morbido e nel vortice per mescolarla. Ruota la coltura a mano per 10-15 secondi, poi versa la coltura sul fondo di una piastra di agar. Inclina la piastra in tutte le direzioni per assicurarti che l'agar morbido copra uniformemente l'agar inferiore.
Copri il piatto e lascialo solidificare da 20 a 30 minuti. Fai attenzione a non disturbare la piastra durante la solidificazione. Una volta solidificato, inserisci da due a cinque microlitri di sovrantante.
Lascia incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente. Osserva e registra i risultati la mattina seguente. Con questo metodo, due ceppi di P. syringae vengono inibiti da diverse batteriocine. Il ceppo A è sensibile a una batteriocina ad alto peso molecolare, la tailocina, ma non è sensibile a un'alternativa a basso peso molecolare.