Isolamento delle cellule epiteliali della vescica del topo contenenti comunità batteriche intracellulari

Inizia con cellule epiteliali della vescica raschiate da una vescica di topo infettata da E. coli uropatogeno marcato con fluorescente.

Durante l'infezione, questi batteri invadono le cellule epiteliali e formano comunità batteriche intracellulari, o IBC—strutture simili a biofilm che li proteggono dalle difese immunitarie dell'ospite.

Al microscopio dissezionante, identificare gli IBC come grandi aggregati fluorescenti confinati all'interno delle singole cellule epiteliali.

Assemblare un sistema di micropipettura a bocca utilizzando un capillare di vetro tirato collegato a una pipetta aspirante per isolare singole cellule epiteliali contenenti IBC.

Immergi brevemente la punta capillare nel PBS per ridurre l'assorbimento di liquidi guidati dai capillari.

Posizionare il capillare vicino alla cellula epiteliale fluorescente selezionata e applicare una dolce aspirazione per attirare una singola cellula contenente IBC, evitando cellule non infette e batteri extracellulari.

Espellere la cellula in un tubo sterile per microcentrifuga usando una leggera pressione positiva, preservando la vitalità batterica.

Questo metodo consente l'isolamento delle cellule epiteliali che ospitano IBC per l'analisi a singola cellula.

Quando tutte le celle sono state raschiate, inserisci l'estremità non tirata di un capillare di vetro tirato nel tappo di gomma di un tubo aspiratore e inserisci saldamente l'estremità stretta di una punta di pipetta da 1 millilitro nell'altra estremità aperta del tubo.

Inserire strettamente l'estremità stretta di una pipetta aspirata da 2 millilitri nell'estremità aperta e più larga della punta da 1 millilitro e posizionare la sospensione a celle raschiate sotto un microscopio dissezionante. Utilizzando un ingrandimento da 20 a 40X, identifica gli IBC come grandi aggregati fluorescenti e immergi l'estremità fine del capillare di vetro in un nuovo tubo di PBS per 1 secondo per ridurre l'assorbimento di volume indesiderato tramite azione capillare.

Quando è stato individuato un IBC di interesse, avvicina lentamente l'estremità aperta del tubo capillare verso l'IBC e applica una forza di aspirazione molto piccola alla pipetta aspirante per guidare l'IBC nel capillare di vetro. Poi, sposta il capillare su un tubo centrifugo vuoto da 1,5 millilitri e applica una leggera pressione positiva per espellere la goccia e l'IBC nel tubo.