JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 3:21 min. • February 26th, 2026
Inizia con una piastra di Petri contenente una co-cultura di Bdellovibrio bacteriovorus, un batterio predatore, e E. coli, la sua preda, sotto un cuscinetto di agarosio.
Il tappeto dell'agarosio mantiene E. coli immobilizzata, mentre B. bacteriovorus rimane mobile e invade attivamente le cellule prede.
Il predatore esprime un marcatore citoplasmatico rosso e un tag fluorescente verde fuso a una sottounità della DNA polimerasi per la visualizzazione.
Fissa il piatto in un supporto e applica olio a immersione sulla base del piatto e sull'obiettivo del microscopio per una risoluzione ottimale.
Monta il supporto sul microscopio e configuralo per il rilevamento della fluorescenza a doppio canale.
Usa ottica a campo chiaro per localizzare il piano focale e selezionare più campi di imaging non sovrapposti.
Imposta i parametri di time-lapse per catturare sia immagini in campo chiaro che fluorescenti in modo sequenziale a intervalli definiti.
Questo metodo consente di osservare la predazione iniziando con l'attacco e l'invasione della preda, seguita dalla trasformazione delle cellule prede, la crescita filamentosa, la septazione, la formazione della progenie e la conclusione con la lisi delle cellule prede.
Per la microscopia a fiorescenza time-lapse della co-cultura, si posiziona la piastra in un supporto per piastre di Petri in modo che la piastra non si muova durante l'esperimento e si inserisce una goccia di olio a immersione sull'obiettivo del microscopio rovesciato e una goccia sul fondo della piastrella. Montare il supporto sul palco del microscopio all'interno della camera del microscopio rovesciato e nel software del microscopio impostare l'ingrandimento a 100X e la lente policroma a GFP e mCherry. Usando un oculare in Brightfield, localizza il piano focale e apri il pointlist manager.
Sposta il palco e usa il pulsante Punti per memorizzare le coordinate di almeno 10 posizioni di interesse. Sposta la valvola della telecamera dall'oculare al monitor. Imposta il piano focale e clicca sul pulsante Sostituisci Punto nel gestore della lista punti per calibrare ogni punto.
Apri il designer dell'esperimento e sblocca la scatola di impilamento malattie. Seleziona i canali fluorescenti appropriati e le impostazioni ottimali di illuminazione e imposta gli intervalli tra l'acquisizione dell'immagine e il tempo totale dell'esperimento. Abilita la manutenzione del focus per le posizioni scelte e seleziona la cartella dati in cui i file immagine devono essere salvati automaticamente.
Controlla tutte le impostazioni nel controllo software del microscopio e avvia l'esperimento time-lapse. Dopo la prima ora dell'esperimento, verifica che tutte le posizioni del palco siano ancora a fuoco. Quando l'esperimento time-lapse è terminato, rimuovere la piastra di Petri e scartare la piastra da 35 millimetri con un tampone di agarosio secondo i protocolli di biosicurezza appropriati.