Saggio basato sulla fluorescenza per indagare le interazioni dei recettori dei macrofagi con gli antigeni batterici

Inizia con la M, etichettata con fluoroforia rossa. antigeni di tubercolosi immobilizzati su una copertura rivestita di polimero.

Aggiungi un buffer di blocco per bloccare i siti di binding non specifici. Lava per rimuovere l'eccesso di blocco.

Introdurre proteine totali estratte dai macrofagi umani, che includono il recettore superficiale cellulare di interesse. Incubare.

I recettori dei macrofagi si legano agli antigeni batterici immobilizzati.

Aggiungere un reticolatore per stabilizzare i complessi recettore–antigene, seguito da un raffreddatore per neutralizzare i reticolatori non reattivi.

Lava e aggiungi un secondo reticulatore per rinforzare i complessi.

Lava di nuovo. Poi, rimuovere il copertura e invertirlo su una soluzione primaria di anticorpi.

Gli anticorpi si legano al recettore dei macrofagi di interesse.

Lavare e invertire il coperto su una soluzione secondaria verde coniugata con fluoroforo, che si lega agli anticorpi primari.

Lava e monta il copertino.

Visualizza il campione al microscopio a fluorescenza. Segnali rossi e verdi co-localizzati confermano l'interazione tra il recettore dei macrofagi e l'antigene batterico.

Utilizzando pinzette chirurgiche a muso rotondo, posiziona delle scure di copertura da 12 millimetri nelle pozze di una piastra di coltura a 24 pozzi.

Incubare il copricapo con Mycobacterium tuberculosis rhodamina antigeni per 1 ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri di estratto proteico diluito in 300 microlitri di PBS e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione. Avvolgi il coperchio della piastra di coltura con una pellicola di paraffina.

Aggiungi una goccia di 60 microlitri di anticorpo primario anti-SLAMF1 precedentemente titolato sul coperchio ricoperto di film di paraffina. Rimuovi con cura il slip di copertura dalla piastra usando pinzette chirurgiche curve a punta fine e aghi. Dopo l'incubazione con soluzione primaria e secondaria per anticorpi, rimuovere il liquido in eccesso e montare il copertino su una goccia di liquido di montaggio posta su un vetrino di vetro. Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza e osservare le cellule usando filtri appropriati.