Imaging ad alto rendimento dell'infezione intracellulare da Brucella abortus nelle cellule epiteliali dell'ospite

Si inizia dalle cellule epiteliali in cui l'espressione della proteina adattatrice dell'interferone, un mediatore chiave dell'immunità innata, è stata ridotta, rendendo le cellule più suscettibili all'infezione da Brucella .

Sostituire il mezzo con un mezzo infettivo contenente Brucella abortus espressa da proteina fluorescente verde e patogeno intracellulare facoltativo, alla concentrazione desiderata.

Centrifugare la piastra per favorire il contatto tra batteri e cellule ospiti, poi incubare per permettere l'internalizzazione batterica.

Lavare le cellule con un mezzo contenente siero e trattale con un antibiotico per eliminare i batteri extracellulari.

Incubare ulteriormente per permettere a Brucella di moltiplicarsi intracellulare.

Lavare le cellule con il tampone e fissarle con paraformaldeide per preservare le strutture intracellulari.

Risciacqua via il fissativo in eccesso. Poi, aggiungi un tampone integrato con detersivo per permeabilizzare le cellule.

Lava via il detersivo residuo, poi aggiungi DAPI per macchiare i nuclei e effettua un lavaggio finale.

Utilizzando un microscopio automatizzato, acquisire immagini ad alto rendimento dell'infezione da Brucella nelle cellule epiteliali dell'ospite.

Utilizzando una lavatrice automatica per piatti, sostituisci il mezzo di trasfezione con 50 microlitri di mezzo infettivo. All'interno della cappa, trasferire la piastra nella gabbia della centrifuga e centrifugare la piastra da 384 pozzi a 400 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Poi, usa il parafilm per sigillare la piastra e incubala su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius e al 5% di_CO2 per quattro ore. Dopo l'incubazione con la lavatrice automatica per piatti, si utilizza DMEM con 10% di FCS contenente 100 microgrammi per millilitro di Gentamicina o GM per lavare le cellule e inattivare i batteri extracellulari. Poi, usa il parafilm per sigillare la piastra e rimettila sulla piastra di alluminio preriscaldata nell'incubatrice per altre 40 ore per il test finale.

Per riparare le celle, prima usa PBS per lavare i pozzi. Successivamente, si scambia il PBS con 50 microlitri di PFA al 3,7% in HEPES 0,2 molari a pH 7,4 e si incubano le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti.

Dopo l'incubazione, si utilizzano 50 microlitri di PBS per scambiare il mezzo di fissazione. Per colorare i campioni con la lavatrice automatica di piatti, si inizia usando 50 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 10 minuti per permeabilizzare le celle.

Dopo aver usato PBS per lavare le cellule tre volte, aggiungi 50 microlitri di PBS con un microgrammo per millilitro di DAPI e incuba a temperatura ambiente per 30 minuti. Poi, usa PBS per lavare le cellule tre volte prima di proteggerle dalla luce. Trasferire la lastra al microscopio automatico.