JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiology
0 visualizzazioni • 2:44 min. • March 31st, 2026
Si inizia con un inserto Transwell contenente una co-coltura di cellule epiteliali e simili a un calice.
Le cellule epiteliali formano giunzioni strette, mentre le cellule simili a calice producono muco, replicando la barriera epiteliale intestinale in vivo.
Assumi una sospensione della comunità batterica orale trattata con liquido intestinale simulato per imitare la digestione dell'intestino tenue.
Sostituisci il substrato nella camera superiore con la sospensione batterica.
Incubare con scuotimento per facilitare l'adesione e l'internizzazione batterica.
Raccogliere il materiale dalla camera superiore contenente batteri non aderenti per i successivi saggi di vitalità.
Aggiungi una soluzione dissolvente del muco e incuba per solubilizzare il muco e liberare i batteri aderiti.
Raccogliere la soluzione per un'ulteriore analisi della vitalità e aderenza batterica.
Lava le cellule con un tampone e aggiungi un detersivo per spostarle.
Raccogli la sospensione della cella.
Vortice la sospensione per lisare le cellule e liberare i batteri interiorizzati.
Centrifugare e raccogliere separatamente il soprannatante e i detriti cellulari per ulteriori analisi.
Dopo aver lavato e regolato la densità cellulare della digestione dell'intestino tenue secondo il protocollo testo, rimuovere il mezzo apicale dal sistema transwell e aggiungere 1,5 millilitri di sospensione batterica.
Co-coltura del sistema in condizioni generali di coltura cellulare per 2 ore. Aggiungere 0,5 millilitri di 10 millimolari n-acetilcisteina in HBSS per solubilizzare il muco prodotto dall'HT29-MTX e recuperare i batteri aderenti.
Incubare le placche a 37 gradi Celsius per 1 ora sotto agitazione. Recuperare il NAC-HBSS in un tubo microcentrifuga e utilizzare 1 millilitro di DPBS per lavare le celle due volte. Aggiungi 0,5 millilitri di tritone X-100 allo 0,5% sopra i monostrati e interrompi le cellule tramite pipetta.
Poi recupera rapidamente il liquido nel vortice per 1 minuto. La rapidità è fondamentale per evitare di danneggiare le cellule batteriche con il detersivo. Analizza i campioni secondo il protocollo testuale.