JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Biological Techniques
0 visualizzazioni • 2:30 min. • July 8th, 2025
La reazione a catena della polimerasi a gradiente è una tecnica per ottimizzare la temperatura di ricottura alla quale i primer - DNA a filamento singolo specifico per la sequenza - si legano ai siti complementari sul DNA stampo.
Prelevare una miscela contenente primer diretti e inversi, dNTP e DNA polimerasi termostabile in un tampone appropriato. Aggiungere il DNA stampo e trasferire i costituenti in una piastra PCR.
Posizionare la piastra in un termociclatore a gradiente con un blocco riscaldante specializzato. Ciò stabilisce un gradiente lineare di temperatura di ricottura compreso tra 55 °C e 65 °C, con un aumento costante della temperatura in tutta la lastra.
La reazione riscalda la piastra ad alta temperatura, denaturando il DNA a doppio filamento in singoli filamenti e attivando la DNA polimerasi. Successivamente, la temperatura viene abbassata in base ai valori programmati in ogni pozzetto, facilitando la ricottura del primer.
A una temperatura di ricottura inferiore a quella ottimale, i primer si legano in modo non specifico al DNA denaturato, portando a un'amplificazione non specifica durante la reazione di PCR. A temperature superiori a quelle ottimali, quantità insufficienti di primer si legano al DNA.
Alla temperatura ottimale, i primer si legano in modo specifico al DNA bersaglio. Quindi, la temperatura aumenta leggermente, consentendo alla polimerasi di estendere i primer utilizzando i dNTP. Questi cicli ripetitivi di denaturazione, ricottura ed estensione portano all'amplificazione del DNA.
Analizza il prodotto in ogni pozzetto. I pozzetti con temperature di ricottura non ottimali mostrano un'amplificazione minore o non specifica.
Una temperatura di ricottura ottimale produce la massima amplificazione specifica del DNA.
Per eseguire una PCR in gradiente, iniziare preparando una miscela master. Quindi, rimuovere 19 microlitri della miscela master per il controllo senza mascherina, o NTC, in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungi il modello al mix master rimanente. Aliquotare 20 microlitri della miscela del campione nella piastra a 96 pozzetti. Eseguire la PCR seguendo i parametri del ciclo, quindi generare i profili di fusione termica, utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto.