Una tecnica in vitro per studiare la formazione di complessi inflammasomici nei macrofagi

Inizia con una piastra contenente una coltura di macrofagi primari.

Introdurre il lipopolisaccaride batterico, LPS, che si lega ai recettori toll-like sui macrofagi, innescando la sovraregolazione del dominio pirina della famiglia NLR contenente 3 o NLRP3.

Aggiungere uno ionoforo che media l'efflusso di ioni potassio. La diminuzione del potassio citosolico attiva NLRP3. NLRP3 attivato oligomerizza e induce il reclutamento di una proteina adattatrice, che a sua volta recluta la pro-caspasi-1, formando un inflammasoma.

L'autoproteolisi converte la pro-caspasi-1 in caspasi-1 attiva, che media la morte cellulare infiammatoria o la piroptosi. Il danno al DNA durante la piroptosi porta alla condensazione nucleare.

Fissare le celle e trattare con un detergente per permeabilizzarle.

Aggiungere un anticorpo primario che si lega alla proteina adattatrice associata all'inflammasoma e un anticorpo secondario marcato in fluorescenza che si lega all'anticorpo primario, marcando l'inflammasoma.

Introdurre una colorazione fluorescente di acido nucleico per etichettare il nucleo. Sotto un microscopio a fluorescenza, le cellule mostrano nuclei condensati – che indicano la piroptosi – e focolai di proteine adattatrici – che indicano la formazione di inflammasomi.

Per l'analisi immunofluorochimica delle cellule trattate con nigericina, lavare le cellule marcate con la sonda e incubare le cellule in 250 microlitri di soluzione di fissazione e permeabilizzazione per pozzetto per 30 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce.

Lavare i macrofagi altre tre volte con un tampone di lavaggio fresco e marcare le cellule con 250 microlitri di anticorpo primario contro la proteina speck-like associata all'apoptosi contenente un dominio di reclutamento della caspasi C-terminale, o ASC, per pozzetto per un'ora su ghiaccio.

Lavare le cellule al termine dell'incubazione ed etichettare i campioni con 250 microlitri dell'anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente appropriato per un'altra ora su ghiaccio, aggiungendo 4 microlitri di un colorante nucleare fluorescente appropriato durante gli ultimi 5 minuti.

Dopo aver lavato le cellule 3 volte in tampone di lavaggio a freddo, montare i vetrini coprioggetti sui vetrini con 7 microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento come dimostrato e visualizzare i macrofagi mediante microscopia confocale a fluorescenza.