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Immunology
0 visualizzazioni • 3:56 min. • July 8th, 2025
Prendiamo una coltura di cellule di cancro al fegato umano, geneticamente modificata per esprimere il polipeptide co-trasportatore del taurocolato di sodio o NTCP, un recettore transmembrana.
Aggiungere il virus dell'epatite B ricombinante, o HBV. Il virus comprende un involucro esterno contenente proteine di superficie e un nucleocapside interno che racchiude il genoma. L'inserimento di un gene reporter della luciferasi inibisce la capacità riproduttiva del virus.
La proteina dell'involucro virale si lega al recettore NTCP della cellula ospite.
NTCP interagisce con il recettore del fattore di crescita epidermico, EGFR, e oligomerizza, inducendo l'endocitosi del virus mediata da EGFR.
L'involucro virale si fonde con la membrana dell'endosoma per rilasciare il nucleocapside, che si disassembla nel complesso dei pori nucleari.
Il genoma virale entra nel nucleo e si converte in DNA circolare chiuso covalentemente o cccDNA – un modello stabile – che codifica per le proteine virali, inclusa la luciferasi.
A intervalli predefiniti, raccogliere le cellule e lisarle per rilasciare la luciferasi intracellulare.
Introduci un substrato reporter. La luciferasi ossida il substrato, producendo un segnale.
Un aumento post-infezione dell'attività della luciferasi indica un'espressione continua del genoma virale.
Piastre di cellule HepG2, che esprimono stabilmente taurocolato di sodio, polipeptide co-trasportatore o NTCP che sono suscettibili all'infezione da HBV e incubano a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.
Un giorno prima dell'infezione, preparare circa 5 x 104 cellule HepG2/NTCP nei pozzetti di una piastra rivestita di collagene a 96 pozzetti in 0,1 millilitri di terreno di coltura. Scongelare l'HPV ricombinante in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, fino a quando non rimane un po' di ghiaccio nella fiala.
Preparare il terreno per l'infezione combinando 78 microlitri di terreno di coltura fresco, due microlitri di DMSO, 10 microlitri di PEG8000 al 40% in 1X PBS e 10 microlitri di HPV ricombinante. Aggiungere 100 microlitri di soluzione ricombinante di HBV a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Un giorno dopo l'infezione, utilizzare 300 microlitri di PBS per lavare la cellula tre volte, per rimuovere la proteina reporter contaminante dalla frazione virale. Aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura contenente il 2% di DMSO alle cellule infette e incubare per una settimana o meno.
Per effettuare l'analisi dell'infezione da HBV, una settimana dopo l'infezione, utilizzare il PBS per lavare le cellule infette tre volte. Aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi alle cellule infette. Agitare la piastra di coltura per cinque minuti, quindi centrifugare a 2000 volte g per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri del substrato reporter a una piastra luminometrica, quindi aggiungere 20 microlitri di lisato cellulare alla piastra e mescolare agitando brevemente. Infine, posiziona la lastra nel luminometro e avvia la lettura.