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Immunology
0 visualizzazioni • 2:37 min. • July 8th, 2025
Durante l'infezione da Porphyromonas gingivalis, le fimbrie sui batteri anaerobi si legano a specifici recettori sulle cellule ospiti.
Questo legame avvia cascate di segnalazione intracellulare, con conseguente riarrangiamento dell'actina e internalizzazione batterica all'interno dei fagosomi.
Per valutare la sopravvivenza di Porphyromonas gingivalis internalizzato all'interno di cellule endoteliali in vitro, prelevare una piastra multipozzetto contenente cellule endoteliali aderenti ai vetrini.
Aggiungere la sospensione di Porphyromonas gingivalis. Incubare per facilitare l'internalizzazione batterica.
Rimuovere il terreno e lavare utilizzando un tampone anaerobico per rimuovere i batteri non internalizzati.
Aggiungere terreni contenenti antibiotici, impermeabili alle cellule endoteliali, per eliminare i batteri attaccati alla superficie.
Incubare con un tensioattivo delicato per lisare le cellule endoteliali, rilasciando i batteri senza causarne la lisi.
Diluire il lisato raccolto con il terreno. Preparare diluizioni seriali del lisato.
Piastra le diluizioni su piastre di agar sanguigno. Incubare in condizioni anaerobiche per consentire a Porphyromonas gingivalis di crescere e formare colonie visibili.
Contare le colonie per valutare la capacità di Porphyromonas gingivalis di invadere e sopravvivere all'interno delle cellule endoteliali.
Dopo l'infezione delle cellule HUVEC, lavare le cellule tre volte con PBS anaerobico. Successivamente, aggiungere 2 millilitri di terreno VEGF integrato con concentrazioni pre-ottimizzate di antibiotici alle cellule HUVAC. Incubare le cellule per un'ora. Aspirare il terreno e aggiungere 2 millilitri di soluzione di saponina all'1% in BHI in ogni pozzetto. Incubare per 15 minuti.
Quindi, raschiare le cellule lisate e raccogliere il lisato in una provetta da centrifuga. Diluire il lisato 1 a 1 con terreno BHI, quindi preparare diluizioni seriali a partire da 1 a 100. Piastra 200 microlitri delle concentrazioni adatte su piastre di agar sanguigno. Lasciare che i batteri crescano per sette giorni in una camera anaerobica, quindi contare le colonie.