JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunology
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Iniziare con una piastra multipozzetto compatibile con la fluorescenza contenente una sospensione di linfociti T transgenici derivati dal topo.
Questi linfociti contengono una proteina fluorescente verde o cassetta di espressione GFP, controllata dal recettore delle cellule T o dall'impegno del TCR con composti immunomodulatori.
Trattare ogni pozzetto con una soluzione contenente composti immunomodulatori con diversi potenziali.
Durante l'incubazione, i composti immunomodulatori interagiscono con i TCR sui linfociti T.
L'interazione del TCR con un composto stimolante innesca l'attivazione della cassetta genica, aumentando l'espressione della GFP.
Al contrario, l'interazione del TCR con un composto inibitorio inibisce la cassetta genica e riduce l'espressione della GFP.
Quindi, sovrapponi le cellule con un colorante fluorescente all'acido nucleico per colorare i nuclei.
Centrifugare la piastra per stabilizzare le celle per una misurazione accurata della fluorescenza.
Al microscopio a fluorescenza, i linfociti T vitali mostrano due segnali di fluorescenza corrispondenti ai nuclei cellulari e alle proteine fluorescenti verdi.
La fluorescenza verde intensificata indica il successo della stimolazione dei linfociti T, mentre un debole segnale di fluorescenza verde intracellulare conferma l'effetto inibitorio dei composti immunomodulatori sui linfociti T.
Per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole, piastra 40 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti e tratta i pozzetti appropriati con il farmaco o il veicolo di scelta per il periodo di trattamento desiderato nell'incubatore per colture cellulari.
30 minuti prima dell'analisi GFP, colorare le cellule con la concentrazione appropriata di soluzione di Hoechst, distribuendo accuratamente la macchia con un pipettaggio delicato. Quando tutti i pozzetti sono stati tinti, centrifugare le piastre per raccogliere le cellule sul fondo dei pozzetti e lasciare riposare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente.
Caricare la piastra secondo le istruzioni del produttore. Quindi, imposta l'obiettivo su 40X o superiore. Impostare il numero di fotocamera 4 per la lampada UV, quindi impostare il numero di fotocamera 1 per il laser 488. Caricare la lastra sul sistema di vagliatura ad alto contenuto. Successivamente, impostare il sistema di screening confocale automatizzato ad alto contenuto per leggere da 6 a 10 campi per pozzetto, con due letture sequenziali per campo a 488 nanometri e luce UV.