Un metodo in vitro per generare organoidi cerebrali umani

Inizia con una coltura di neurosfere, gruppi fluttuanti di cellule progenitrici neuroepiteliali.

Trasferisci queste neurosfere su un foglio di inclusione.

Rimuovi i supporti. Aggiungere una goccia di matrice di membrana extracellulare contenente proteine e fattori di crescita a ciascuna neurosfera.

Incubare per solidificare la matrice, incorporando le neurosfere al suo interno.

Ora, trasferisci le neurosfere incorporate nella matrice utilizzando i terreni di neurosfera su una piastra di coltura contenente terreni di neurosfera.

incubare. La matrice di membrana extracellulare e i suoi costituenti facilitano la differenziazione delle cellule progenitrici neuroepiteliali in cellule neuroepiteliali che proliferano e formano lumi pieni di liquido.

Dopo l'incubazione, trasferire le neurosfere in un pallone rotante contenente terreni organoidi cerebrali preriscaldati. Incubare con agitazione per una maggiore diffusione dell'ossigeno e dei nutrienti, favorendo la crescita cellulare.

I fattori di crescita e gli inibitori di piccole molecole nei terreni promuovono la differenziazione neurale e si sviluppano in cellule di specifiche regioni cerebrali, formando organoidi cerebrali maturi.

Per iniziare questa procedura, raccogliere le neurosfere con una micropipetta da 200 microlitri, utilizzando una punta da 2 millimetri precedentemente tagliata con forbici sterili. Quindi, posizionare le neurosfere a circa 5 millimetri di distanza l'una dall'altra su un film di paraffina in un piatto da 100 millimetri e rimuovere con cura la maggior parte del mezzo rimanente. Quindi, aggiungere una goccia di matrice EHS su ogni singola neurosfera.

Incubare le gocce di matrice EHS con le neurosfere per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare accuratamente le neurosfere dal film di paraffina sciacquandole con il mezzo neurosferico. Successivamente, incubare le neurosfere per i successivi quattro giorni e aggiungere 2 millilitri di terreno di neurosfera fresco il secondo giorno.

In questa procedura, aggiungere 100 millilitri di terreno organoide cerebrale a ciascun pallone attraverso i suoi bracci laterali e preriscaldare il terreno nell'incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Quindi assicurati che le neurosfere siano tutte separate. Se due o più sono collegati tramite matrice EHS, separarli tagliando la matrice di collegamento con un bisturi.

Impostare un programma di agitazione a 25 giri/min. Trasferire con cautela le neurosfere incorporate nella matrice EHS nei palloni rotanti contenenti 100 millilitri di terreno organoidico. Successivamente, posizionare le fiasche rotanti su una piattaforma di agitazione magnetica nell'incubatrice per 14 giorni a 37 gradi Celsius. Questo è il giorno zero della coltura degli organoidi. Cambia il terreno una volta alla settimana rimuovendo metà del terreno e aggiungendo la stessa quantità di terreno fresco.