JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:30 min. • July 8th, 2025
Prendi un occhio di topo intatto nel liquido cerebrospinale artificiale, o aCSF, e incidi per isolare l'oculare contenente la retina.
Trattare con una soluzione enzimatica per rimuovere la membrana limitante interna, esponendo le cellule neuronali.
Immergere il tessuto in una soluzione inibitoria per fermare la digestione e lavare per rimuovere la soluzione in eccesso.
Porre il tessuto in un incubatore specializzato a bassa temperatura per rallentare il metabolismo cellulare, preservando il tessuto.
Questo incubatore è composto da una camera principale con una rete per il montaggio dei tessuti. La camera è riempita con aCSF e la sua temperatura e il suo pH sono controllati per preservare la funzionalità dei tessuti.
Per eliminare la contaminazione microbica, l'aCSF viene pompato in un'altra camera e trattato con radiazioni ultraviolette per uccidere eventuali microbi.
L'aCSF sterilizzato viene quindi pompato nuovamente nella camera principale.
Per isolare la retina, rimuovere l'oculare, separare la retina dal tessuto circostante e rimetterla nell'incubatrice.
Per la preparazione dell'intera montatura retinica, enucleare immediatamente gli occhi da un animale soppresso. Fai un piccolo taglio lungo l'ora serrata e posiziona gli occhi in Ames Media o aCSF con apporto di carbogeno a temperatura ambiente. Dopodiché, rimuovere immediatamente la cornea, il cristallino e il vitreo tagliando lungo l'ora serrata con piccole forbici e rimuoverli con una pinza. Posizionare il fazzoletto nel sistema di incubazione a temperatura ambiente.
Per rimuovere la membrana limitante interna, trasferire la conchiglia oculare contenente la retina in un piccolo barattolo di vetro contenente papaina, L-cisteina, EDTA e DNAsi a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Applicare il carbogeno alla soluzione attraverso il coperchio, ma non far bollire. Arrestare la digestione enzimatica mettendo il tessuto in una soluzione di ovomucoide e BSA per 10 minuti in Earl's BSS. Quindi, lavare accuratamente il fazzoletto con aCSF.
Successivamente, trasferire il tessuto nel sistema di incubazione e ridurre la temperatura a circa 15-16 gradi Celsius. Successivamente, trasferire il tessuto retinico al microscopio; Isolare la retina dalla conchiglia oculare e tagliarla in quattro pezzi con una lama di rasoio. Se è necessaria l'intera retina, fai quattro piccoli tagli nella periferia della retina per consentirle di rimanere piatta.
Questo tessuto può ora essere trasferito al microscopio per l'elettrofisiologia o mantenuto nel Braincubator. Il tessuto viene mantenuto nella camera principale contenente le sonde per le misure di pH e temperatura. Una seconda camera è isolata dalla camera principale ed è esposta a 1,1 watt di luce UVC per irradiare i batteri che galleggiano nella soluzione. Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'aCSF attraverso le due camere e una piastra di raffreddamento termoelettrica Peltier per raffreddare o riscaldare la camera principale.