JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
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Iniziare con una sospensione cellulare di cellule progenitrici ematopoietiche geneticamente modificate.
Queste cellule esprimono i fattori di trascrizione necessari per la loro riprogrammazione in cellule staminali neurali. Questo processo è chiamato riprogrammazione diretta.
Trasferire le cellule in una piastra multipozzetto rivestita di matrice extracellulare con un mezzo progenitore neurale e incubare.
La matrice extracellulare fornisce un'impalcatura tridimensionale per l'adesione e la crescita cellulare.
Durante l'incubazione, i fattori di trascrizione espressi dalla cellula progenitrice ematopoietica avviano una sequenza di eventi molecolari che ne permettono la trasformazione in cellula staminale neurale.
Il mezzo progenitore neurale contiene fattori che favoriscono la sopravvivenza delle cellule staminali neurali indotte.
Dopo l'incubazione, sostituire questo terreno con un nuovo terreno progenitore neurale per promuovere la moltiplicazione cellulare.
Staccare le cellule utilizzando un raschietto per cellule.
Raccogli questa sospensione e trasferisci le cellule in un pozzetto contenente terreno di cellule staminali neurali.
Incubare per il mantenimento delle cellule staminali neurali indotte.
Quando le cellule sono confluenti al 30-50%, aspirare il surnatante e riservarlo, quindi aggiungere 1 millilitro di terreno progenitore neurale a ciascun pozzetto. Per realizzare una piastra di riserva utilizzando le sfere nel surnatante, centrifugare il surnatante di riserva a 170 volte g per 10 minuti.
Quindi, aspirare il surnatante e risospendere il pellet nel mezzo progenitore neurale. Piastra in una piastra a 24 pozzetti rivestita in matrigel; Cambiare il mezzo in ogni piastra di celle a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono dal 60% all'80% di confluenza, di solito dopo una settimana.
Una volta che le cellule raggiungono la confluenza richiesta, aspirare il surnatante e aggiungere 1 millilitro di terreno di cellule staminali neurali a ciascun pozzetto. Quindi, dissociare le cellule utilizzando un raschietto cellulare seguito da un pipettaggio molto delicato.
Quindi, trasferire le celle da un pozzetto della piastra a 24 pozzetti in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere un altro millilitro di terreno al pozzetto e, dopo aver ripetuto la procedura per tutti i pozzetti, posizionare la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica.
Cambiare l'intero volume del terreno a giorni alterni fino a quando le celle raggiungono il 60% di confluenza. Dopo ogni volta, dissociare e riplaccare le cellule con un rapporto di 1 a 3 come appena mostrato.