JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:03 min. • July 8th, 2025
Iniziare con due piastre a più pozzetti: una con un fondo inciso rivestito con un polimero e l'altra con un vetrino coprioggetti rivestito in polimero.
Seminare una sospensione ad alta densità dei neuroni embrionali nella piastra con il fondo inciso. Aggiungere una sospensione neuronale a bassissima densità al vetrino coprioggetti contenente pozzetto.
Incubare per consentire l'adesione neuronale ai polimeri.
Rimuovere il vetrino coprioggetti e posizionarlo sopra la coltura di neuroni ad alta densità, consentendo ai neuroni di guardarsi l'un l'altro.
La superficie incisa con strutture elevate crea un micro-spazio che separa neuroni di diversa densità.
La coltura ad alta densità funge da strato di alimentazione e secerne il fattore di crescita neurale.
A causa dello spazio di diffusione ristretto, i fattori di crescita si accumulano intorno ai neuroni, facilitando la loro crescita e lo sviluppo di proiezioni neuronali.
Introdurre un terreno neurobasale con citosina arabinoside che inibisce selettivamente la crescita delle cellule non neuronali.
Reintegrare regolarmente con un terreno neurobasale fresco per mantenere la coltura neuronale.
In questa procedura, posizionare piastre a 24 pozzetti con fondo inciso per neuroni ad alta densità nella cappa di coltura. Rimuovere 300 microlitri del terreno precondizionato sottovuoto. Quindi, piastra 0,6 millilitri di sospensione cellulare ad alta densità a 250.000 neuroni per millilitro.
Posizionare le altre piastre da 224 pozzetti con vetrini coprioggetti nel cappuccio di coltura. Rimuovere 300 microlitri del terreno precondizionato con il vuoto, prima di placcare 0,6 millilitri di sospensione cellulare a bassa densità a 10.000 neuroni per millilitro sui vetrini. Successivamente, rimettere tutte le piastre da 24 pozzetti nell'incubatore e incubare per due ore. Dopodiché, capovolgi i vetrini coprioggetti a bassa densità con i neuroni aderenti alla coltura ad alta densità e assicurati che i neuroni siano uno di fronte all'altro. Successivamente, rimettere le due piastre con la cocoltura nell'incubatrice.
Alimentare le co-colture aggiungendo 300 microlitri di terreno di coltura fresco al DIV 5. Dopo questa poppata iniziale, aggiungere 300 microlitri di terreno di alimentazione fresco senza citosina arabinoside a ciascun pozzetto ogni settimana. Se la coltura viene conservata per più di un mese, sostituire metà del terreno con terreno di alimentazione fresco ogni settimana, oltre il periodo di un mese.