Differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte in astrociti

Prelevare una coltura di cellule progenitrici neurali indotte, o iNPC, su una piastra multipozzetto rivestita di proteine della matrice extracellulare.

Sostituire il terreno con un terreno di induzione gliale e incubare. I fattori di crescita e gli ormoni nei terreni facilitano la differenziazione delle iNPC in cellule precursori gliali.

Cambiare i terreni a giorni alterni per la proliferazione cellulare. Quindi, sostituire il terreno con il terreno di coltura degli astrociti e incubare.

Nutrienti specifici e fattori di crescita nei terreni guidano la differenziazione delle cellule precursori gliali in astrociti.

I cambiamenti dei terreni a giorni alterni promuovono la maturazione degli astrociti.

Cambiare il terreno in neuro-diff-medium quando le cellule sono confluenti per circa il 70% e continuare a cambiare il mezzo a giorni alterni per tre settimane. Non dividere le cellule durante la differenziazione. Dopo tre settimane, le cellule dovrebbero esprimere il marcatore neuronale TuJ1.

Per ottenere neuroni e sottotipi neuronali più maturi, continuare la differenziazione fino a tre mesi. Per la differenziazione delle iNPC in modo specifico verso una linea gliale, cambiare il mezzo con il mezzo di induzione gliale, inclusi 20 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita epidermico per indurre la differenziazione in cellule precursori gliali. Rimuovere metà del terreno e sostituirlo con un terreno fresco a giorni alterni per circa due settimane.

Durante questo periodo, le cellule devono essere divise da 1 a 3 in presenza di 10 inibitori micromolari della Rho-chinasi quando viene raggiunta la confluenza del 100%. Dopo due settimane, differenziare ulteriormente le cellule in astrociti cambiando il terreno in terreno astrocitario disponibile in commercio quando le cellule sono quasi confluenti e continuando a cambiare il mezzo ogni due giorni. Circa sette giorni dopo, le cellule iniziano a esprimere marcatori astrocitari.