JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:13 min. • July 8th, 2025
Prendi una sospensione di astrociti.
Aggiungere una soluzione bioink contenente gelatina, derivati della gelatina fotoreticolabili, fotoiniziatori, fibrinogeno e laminina.
Trasferire la sospensione in una siringa con un ago smussato.
Raffreddare la siringa per la gelificazione bioink. Collegare la siringa alla testina di stampa della biostampante.
Posizionare l'ago in modo appropriato sulla piastra di coltura. Avvia il bioprinting con i parametri impostati e il design.
Il bioink contenente astrociti viene spinto fuori dall'ago e depositato a strati sulla piastra, formando una struttura tridimensionale con astrociti intrappolati.
Esporre il costrutto biostampato alla luce ultravioletta. Il fotoiniziatore aiuta la reticolazione dei derivati della gelatina, migliorando la stabilità del biocostrutto.
Trattare con trombina e ioni calcio.
La trombina, con ioni calcio, converte il fibrinogeno in fibrina, assemblandosi in una rete stabile di biopolimeri 3D.
Scartare la soluzione e lavare con tampone per rimuovere gli agenti reticolanti.
Aggiungere terreni di coltura per astrociti e incubare. La laminina aiuta l'adesione e la diffusione degli astrociti, formando un tessuto simile a un neurale 3D ricco di astrociti.
Per ottenere una concentrazione finale di 1 x 106 cellule per millilitro, trasferire 1 millilitro di soluzione gelatina-gelatina-metacriloil-fibrinogeno nella provetta contenente le cellule e omogeneizzare pipettando delicatamente su e giù. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per trasferire lentamente gli astrociti deposti nella soluzione bioink gelatina-gelatina-metacriloil-fibrinogeno in una siringa di plastica da 5 millilitri, evitando la formazione di bolle. Collegare un ago smussato sterile calibro 22 alla siringa.
Esporre il bioprinter ai raggi UV per 15 minuti, quindi pulire il bioprinter con etanolo al 70%. Quindi collegare la siringa alla testina di stampa del bioprinter e lavare manualmente il bioink per rimuovere le bolle rimanenti.
Per eseguire il bioprinting, posizionare un piatto di coltura da 35 millimetri sul tavolo della biostampante. Posizionare l'ago a 0,1 millimetri di distanza dalla superficie della piastra di coltura per consentire il movimento dell'ago e premere il pulsante Stampa. Una volta terminato il bioprinting, assicurarsi che la siringa si allontani dalla piastra e chiudere la capsula di coltura. Posizionare il piatto di coltura sotto la luce UV per la reticolazione gelatina-metacriloil.
Utilizzare una spatola sterile per trasferire il costrutto biostampato su una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di soluzione di cloruro di calcio trombina e lasciare agire per 30 minuti per consentire la reticolazione della fibrina. Dopo aver rimosso la soluzione reticolante, lavare il costrutto con 2 millilitri di PBS. Quindi, sostituire il PBS con 1 millilitro di terreno di coltura per astrociti. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e cambiare il terreno ogni tre giorni.