Dissociazione e coltura di neuroni da campioni di tessuto ippocampale

Inizia con campioni di tessuto ippocampale contenenti neuroni e varie cellule non neuronali.

Aggiungere una soluzione enzimatica di proteasi. L'enzima degrada la matrice extracellulare del tessuto, avviando la dissociazione cellulare.

Lavare con un mezzo di placcatura per rimuovere gli enzimi residui.

Pipettare ripetutamente il tessuto digerito per dissociare meccanicamente le cellule dal tessuto, formando una sospensione unicellulare.

Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le celle nel mezzo di placcatura.

Seminare le cellule su un vetrino coprioggetti rivestito di poli-D-lisina in una piastra a più pozzetti. La lisina migliora l'attaccamento cellulare.

Sostituire il mezzo di placcatura con un mezzo di mantenimento dei neuroni contenente nutrienti essenziali per la sopravvivenza dei neuroni.

Rinfrescare metà del terreno con terreno di mantenimento contenente arabinosilcitosina o Ara-C.

L'Ara-C entra nelle cellule e inibisce selettivamente la crescita delle cellule non neuronali, portandone alla morte.

Sostituisci i supporti con nuovi terreni di manutenzione per supportare la sopravvivenza dei neuroni.

Per dissociare i neuroni dell'ippocampo per la coltura, scongelare la soluzione dell'enzima proteasi e preriscaldare il mezzo di placcatura a 37 gradi Celsius. Quindi, sciacquare l'ippocampo sezionato con SLDS. Quindi rimuoverlo e aggiungere 2 millilitri di soluzione di enzima proteasi e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Successivamente, lavare due volte gli espianti di ippocampo con 5-10 millilitri di terreno di placcatura e aggiungere 5 millilitri di terreno di placcatura. Dissociare gli espianti ippocampali in singole cellule generando un piccolo vortice utilizzando una pipetta con punta di plastica da 1 millilitro. Pipettare su e giù circa 40 volte, evitando la formazione di bolle di ossigeno fino a quando la soluzione diventa torbida e non rimangono grossi pezzi di espianto.

Quindi, centrifugare le celle a 1.125 volte la gravità per 3 minuti. Rimuovere il surnatante con le cellule immerse nel terreno e risospendere le cellule in 145 millilitri di terreno di placcatura. Quindi, aggiungere 1 millilitro di sospensione cellulare per pozzetto a una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule nel mezzo di placcatura a 37 gradi Celsius per due o quattro ore.

Successivamente, rimuovere il mezzo di placcatura e sostituirlo con un nuovo mezzo di manutenzione. Dopo due giorni, sostituire metà del terreno con due micromolari di Ara-C disciolti nel terreno di mantenimento per inibire la crescita dei fibroblasti, delle cellule endoteliali e gliali. Quindi, dopo aver esposto le cellule ad Ara-C per due giorni, sostituire il terreno con un nuovo terreno di mantenimento.