JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 2:57 min. • July 8th, 2025
Prendi un dispositivo microfluidico rivestito con un polimero sintetico e una proteina di adesione.
Il dispositivo è costituito da pozzetti e camere di coltura interconnesse separate da microscanalature.
Le camere contengono fori per il posizionamento del tessuto.
Da un embrione di topo si ottengono i gangli del trigemino, un insieme di corpi cellulari di neuroni trigeminali, e i germi dei denti, strutture prenatali che si sviluppano in denti adulti.
Posizionare i fazzoletti nei fori e aggiungere i rispettivi terreni di coltura.
I nutrienti e le vitamine nel mezzo germinale del dente facilitano la sopravvivenza del germe del dente durante la coltura.
La superficie rivestita del dispositivo e i fattori di crescita nei gangli del trigemino facilitano la crescita dei neuriti e degli assoni.
Gli assoni raggiungono la camera germinale del dente attraverso le microscanalature.
I segnali derivati dal dente portano alla repulsione neuronale, consentendo agli assoni di circondare il germe del dente senza innervarlo.
Lavare le camere di coltura con tampone e fissare i tessuti con un fissativo.
La co-coltura è ora pronta per ulteriori analisi.
Dopo la dissezione dei gangli del trigemino e dei germi dei denti, rimuovere la laminina dai dispositivi microfluidici e riempire le camere con 200 microlitri dei rispettivi mezzi. Con una pinza, trasferire delicatamente i gangli del trigemino sezionati e i germi dei denti nei fori creati con un punzone per biopsia. Assicurarsi che i germi dei denti non galleggino e che affondino fino a quando non toccano i vetrini.
Coltivare i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Cambiare il terreno di coltura ogni 48 ore per 10 giorni. Per cambiare il terreno, per prima cosa, rimuovere il mezzo puntando la pipetta verso il lato esterno dei pozzetti. Quindi, aggiungere il terreno fresco preriscaldato sul lato dei pozzetti situati di fronte alle camere.
Durante il periodo di coltura, visualizzare le co-colture in qualsiasi momento utilizzando la microscopia ottica. Dopo il periodo di coltura, lavare le camere pipettando 150 microlitri di PBS in un pozzetto per camera e lasciando che il PBS fluisca attraverso le camere. Ripetere il lavaggio per un totale di tre volte.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il PBS e fissare i campioni pipettando 150 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS in un pozzetto per camera e lasciandolo fluire nell'altra camera. Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, lavare le camere due volte con PBS e procedere con ulteriori analisi, come la colorazione in immunofluorescenza e l'imaging della crescita.