Differenziazione delle cellule embrioidi del corpo in progenitori neurali utilizzando l'acido retinoico

Inizia con le cellule staminali embrionali coltivate su uno strato di cellule alimentatrici di fibroblasti, che mantengono le cellule staminali nel loro stato indifferenziato.

Aggiungi enzimi tripsina e EDTA per interrompere l'adesione da cellula a cellula e staccare le cellule.

Successivamente, aggiungere un terreno di coltura arricchito con siero per fermare l'attività enzimatica e trasferire la sospensione cellulare in una provetta.

Centrifugare per raccogliere le cellule, rimuovere il surnatante e quindi risospendere le cellule in un mezzo contenente acido retinoico.

Posizionare le goccioline di questa sospensione cellulare sulla base di una piastra di coltura non adesiva.

Capovolgere la base per formare gocce pendenti e posizionarla sopra il coperchio della piastra di coltura riempito con un tampone per evitare che le goccioline si secchino.

Nelle gocce sospese, la gravità fa sì che le cellule si depositino sul fondo, aggregandosi infine in strutture tridimensionali chiamate corpi embrioidi.

Inoltre, le cellule assorbono l'acido retinoico, che modula varie vie di segnalazione intracellulare.

Questa modulazione stimola la differenziazione delle cellule staminali in cellule progenitrici neurali con la capacità di produrre neuroni.

Inizia la formazione del corpo embrioide raccogliendo cellule staminali embrionali con lo 0,25% di tripsina-EDTA per 2-5 minuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Aggiungere il terreno di Dulbecco modificato di Iscove o IMDM fresco con il 15% di FBS alle cellule di distacco, quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Centrifugare a 160 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare una sospensione 5 x 10⁵ cellule per millilitro in IMDM con acido retinoico 0,5 micromolare. Quindi, utilizzare una pipetta a 8 canali e puntali da 200 microlitri per preparare gocce da 120 microlitri per piastra di Petri da 100 millilitri. Capovolgere il piatto e riempire il coperchio capovolto con PBS per evitare che le gocce pendenti si secchino. Coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 3 o 4 giorni.