JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 4:39 min. • July 8th, 2025
Prendi un cucciolo di corteccia di topo.
Aggiungere un enzima proteolitico che digerisce la matrice extracellulare del tessuto. Quindi, dissociare meccanicamente il tessuto, allentando le cellule.
Aggiungere terreni gliali e DNasi per degradare il DNA contaminante.
Dissociare meccanicamente il tessuto per rilasciare neuroni e cellule gliali.
Una volta che il tessuto non digerito si è depositato, raccogliere il terreno contenente le cellule e centrifugare. Rimuovere il surnatante.
Risospendere le cellule nei media gliali e piastarle su un pallone rivestito di proteine della matrice extracellulare.
incubare. Gli astrociti aderiscono più fortemente alla superficie rivestita rispetto ad altre cellule. I terreni gliali promuovono solo la sopravvivenza delle cellule gliali.
Sostituire il supporto per rimuovere i detriti.
Incubare con agitazione per staccare le cellule precursori degli oligodendrociti sovrastanti, le OPC e la microglia.
Trasferire il terreno con le cellule su una piastra di coltura.
Incubare agitando per facilitare l'adesione microgliale differenziale.
Trasferire il surnatante OPC non aderente su una piastra multipozzetto rivestita di poli-D-lisina. Incubare per l'aderenza all'OPC.
Sostituire il supporto con un supporto OPC, consentendo la crescita OPC.
Aggiungere 1 millilitro di tripsina allo 0,05% con EDTA 0,53 millimolare a ciascuna provetta con tessuto. Triturare la miscela con una pipetta da 10 millilitri circa 20 volte. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico vuoto da 50 millilitri.
Incubare la soluzione a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 15 minuti, agitando delicatamente i lisati dopo otto minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 5 millilitri di MGM e 200 microlitri di DNasi-I a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Triturare ogni lisato 10 volte con una pipetta da 10 millilitri.
Quindi, lasciare riposare la sospensione cellulare per tre minuti a temperatura ambiente per consentire al tessuto non dissociato di depositarsi sul fondo del tubo. Trasferire le sospensioni cellulari in nuove provette coniche da 50 millilitri, lasciando dietro di sé il tessuto non dissociato. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 5 millilitri di MGM e triturarlo 20 volte.
Piastra le sospensioni cellulari su fiasche rivestite di T-25 e incuba le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per eseguire l'isolamento delle cellule precursori degli oligodendrociti, agitare le cellule per 15 ore. Quindi, rimuovere il surnatante dal pallone e impiattarlo su una capsula di Petri sterile.
Incubare il surnatante a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti, agitando dopo 15 minuti per rimuovere le microglia rimanenti. Rimuovere il surnatante cellulare non aderente. Contare le cellule e piastarle su una superficie rivestita di poli-D-lisina alla concentrazione desiderata.
Rimettere le cellule nell'incubatrice per almeno un'ora. Quindi, aspirare delicatamente il 95% del terreno e aggiungere lentamente il terreno OPC caldo, pipettandolo contro la parete del pozzetto per ridurre al minimo l'interruzione degli OPC.