Miglioramento della differenziazione delle cellule staminali con un trattamento transitorio con DMSO

Inizia con una piastra multipozzetto contenente cellule staminali pluripotenti umane aderenti con capacità di differenziazione multilineare.

Introdurre un mezzo di cellule staminali contenente dimetilsolfossido o DMSO.

Il DMSO entra nelle cellule e impedisce la progressione del ciclo cellulare dalla fase Gap 1, o G1, una fase iniziale del ciclo cellulare, alla sintesi, o fase S.

Questo crea una popolazione uniforme di cellule nella fase G1, migliorando la loro capacità di differenziazione.

Sostituire il terreno con un mezzo di differenziazione ectodermica ricco di sostanze nutritive contenente inibitori delle vie di segnalazione BMP e TGF-β.

Questi inibitori si legano a specifici recettori ALK sulle cellule staminali, bloccando le vie di segnalazione BMP e TGF-β e impedendo la loro differenziazione in precursori dell'endoderma e del mesoderma.

Ciò consente la differenziazione selettiva delle cellule staminali arrestate con G1 in precursori ectodermici dotati di capacità di differenziazione neurale.

Sostituire regolarmente il terreno con un terreno nuovo per mantenere i livelli di nutrienti e fattori di differenziazione, garantendo la sopravvivenza cellulare.

Pretrattare le cellule con DMSO come descritto per le colture 2D e preparare Noggin e SP431542 soluzioni stock. Preparare una quantità sufficiente di siero knockout al 10% o KOSR in DMEM knockout per tre o quattro giorni di cambio del terreno. Preparare i terreni di differenziazione ectodermica aggiungendo Noggin e SP431542 al DMEM knockout KOSR preriscaldato come descritto nel manoscritto.

Dopo il pretrattamento con DMSO, aspirare il terreno dalle cellule e aggiungere 2 millilitri di terreno di differenziazione a ciascun pozzetto. Lasciare incubare le cellule per tre o quattro giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica, sostituendo quotidianamente i terreni con nuovi fattori di differenziazione.