JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:51 min. • July 8th, 2025
Inizia con un cervello murino con cellule neurali, non neurali e immunitarie all'interno della matrice extracellulare del cervello o ECM.
Tritare il tessuto e risospenderlo in un terreno di coltura.
Trasferire questi frammenti di tessuto in una provetta e trattarli con collagenasi ed enzimi DNasi-I.
La collagenasi digerisce la MEC, rilasciando singole cellule, mentre la DNasi-I degrada il DNA libero per prevenire l'aggregazione cellulare.
Quindi, aggiungere EDTA per inattivare gli enzimi collagenasi.
Aggiungere un terreno di coltura. Centrifugare e rimuovere il surnatante.
Aggiungere una soluzione di gradiente di densità e il terreno di coltura al pellet cellulare, creando uno strato di gradiente a bassa densità.
Mescolare e quindi stendere la soluzione con una soluzione a gradiente ad alta densità per stabilire una differenza di densità.
Centrifugare a bassa velocità per separare le cellule immunitarie all'interfaccia, con detriti cellulari più leggeri nella parte superiore e cellule neuronali e gliali più pesanti nella parte inferiore.
Rimuovere lo strato superiore, raccogliere le cellule immunitarie e trasferirle in un'altra provetta.
Centrifugare e rimuovere il surnatante, quindi risospendere le cellule in un terreno, formando una sospensione a cellula singola per applicazioni a valle.
Versare il tessuto cerebrale o del midollo spinale con il terreno in una piastra di Petri da 100 millimetri e utilizzare una pinza per spostare il tessuto sul fondo. Tritare il tessuto cerebrale con una lama di rasoio sterile e raccogliere il tessuto sul fondo della piastra. Aggiungere 3 millilitri di RPMI integrati con il 10% di FCS alla piastra di Petri, quindi utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per risospendere il tessuto nel terreno e trasferirlo in una provetta conica da 15 millilitri.
Aggiungere collagenasi di tipo I e DNasi I al tessuto e incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Capovolgere le provette ogni 15 minuti per mescolare accuratamente il tessuto con gli enzimi. Dopo l'incubazione, aggiungere EDTA a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 0,01 molare e incubare le provette per altri cinque minuti per inattivare la collagenasi.
Aggiungere 9 millilitri di RPMI, integrati con il 10% di FCS a ciascuna provetta, quindi centrifugare le provette a 450 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta Pasteur con vuoto per aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare.
Aggiungere 3 millilitri di soluzione stock al 100% di gradiente di densità isotonica al pellet cellulare. Quindi, aggiungere ulteriori supporti RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 10 millilitri e risospendere il pellet della cella. Capovolgere e mescolare bene il tubo. Quindi, inserire una pipetta sierologica con 1 millilitro di soluzione stock di gradiente di densità isotonica al 70% sul fondo della provetta.
Stendere lentamente la soluzione, facendo attenzione a non formare bolle. Rimuovere la pipetta sierologica dalla provetta, facendo attenzione a non disturbare la sfumatura. Centrifugare la provetta a 800 g per 30 minuti a 4 gradi Celsius, quindi aspirare il surnatante, compreso lo strato di detriti di mielina, fino a quando rimangono da 2 a 3 millilitri nella provetta.
Utilizzare una pipetta da 1 millilitro per raccogliere lo strato cellulare compreso tra il gradiente di densità del 30% e il 70% e trasferirlo in una nuova provetta da 15 millilitri. Aggiungere il terreno RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 15 millilitri, quindi centrifugare le celle a 450 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.