JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:14 min. • July 8th, 2025
Trasferire un pezzo di tessuto cerebrale umano fresco congelato in un macinino adatto contenente tampone di lisi fredda.
Muovi il pestello su e giù per rompere meccanicamente il tessuto, rilasciando le cellule.
Le molecole detergenti nel tampone di lisi rompono la membrana cellulare, liberando i nuclei.
Trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga adatta e aggiungere un tampone di saccarosio freddo sul fondo della provetta, creando un gradiente di densità.
Centrifugare ad alta velocità per separare i nuclei sul fondo della provetta.
Scartare il surnatante e risospendere i nuclei in una soluzione salina tamponata.
Aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori specifici per il bersaglio ai nuclei e incubare per consentire all'anticorpo di legarsi alla proteina nucleare bersaglio.
Aggiungere un colorante di colorazione nucleare per visualizzare il DNA intatto.
Esegui lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza per ordinare i nuclei di diverse popolazioni cellulari in base a segnali di fluorescenza distinti.
Iniziare a sezionare circa 200-400 milligrammi di tessuto da un campione di tessuto di corteccia adulta umana fresco e congelato. Metti il tessuto in un Douncer di vetro da 7 millilitri contenente 4 millilitri di tampone di lisi ghiacciato su ghiaccio e macina il tessuto circa 50 volte.
Trasferire l'omogeneizzato in una provetta in polipropilene per ultracentrifuga da 12 millilitri. Utilizzare una pipetta da 5 millilitri per aggiungere 6,5 millilitri di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo della provetta dell'ultracentrifuga senza disturbare l'interfaccia tra il saccarosio e l'omogeneizzato tissutale.
Per raccogliere i nuclei, ultracentrifugare il lisato per un'ora a 101.814 volte g e aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet. Aggiungere PBS alla provetta dell'ultracentrifuga, rimettendo in sospensione il pellet di nuclei.
Per la selezione attivata dalla fluorescenza dei nuclei isolati, aggiungere circa 20 microlitri del campione risospeso a una soluzione anticorpale contenente l'anticorpo anti-NeuN di topo coniugato AlexaFlour555. Aggiungere circa 20 microlitri del campione risospeso a una soluzione anticorpale contenente anticorpi anti-PAX6 di topo coniugato con APC. Dopo un'incubazione di un'ora, a 4 gradi Celsius con agitazione al riparo dalla luce, aggiungere DAPI in rapporto da 1 a 1.000 a tutti i campioni e controlli.