JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:10 min. • July 8th, 2025
Posizionare una retina murina su un colino cellulare inumidito e macerare con un movimento circolare per separare le cellule retiniche dalla matrice extracellulare.
Trasferire il colino in una provetta di raccolta.
Aggiungere un tampone fosfato e una soluzione di siero al colino per lavare e raccogliere le cellule.
Centrifuga per la sedimentazione delle cellule. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone fosfato e in una soluzione di siero.
Aggiungere anticorpi bloccanti che si legano ai recettori Fc sulle cellule, impedendo il legame non specifico degli anticorpi bersaglio.
Successivamente, aggiungere anticorpi primari marcati in fluorescenza e non marcati che si legano a specifici marcatori di superficie cellulare su vari tipi di cellule.
Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.
Aggiungere un anticorpo secondario marcato in fluorescenza per legarsi all'anticorpo primario non marcato.
Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.
Eseguire la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, o FACS, per catturare i segnali fluorescenti distinti delle cellule marcate e ordinare le cellule gangliari retiniche da varie popolazioni di cellule retiniche.
Posizionare fino a 12 retine su un colino di nylon sterile da 70 micron inumidito con PBS e FBS e macerare delicatamente la retina con l'estremità posteriore di uno stantuffo a siringa da 10 millilitri con un movimento circolare. Quando tutte le cellule sono state dissociate, posizionare il filtro su una provetta di raccolta in polipropilene e utilizzare una pipetta P1000 per filtrare le cellule attraverso il filtro nella provetta di raccolta.
Sciacquare il colino con PBS e FBS, raccogliendo il lavaggio nella provetta di raccolta. Aggiungere abbastanza PBS più FBS per portare il volume finale fino a 1 millilitro di soluzione per retina e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi, risospendere il pellet in PBS più FBS a 1 millilitro di terreno per 5 concentrazioni di retina. Successivamente, bloccare qualsiasi legame del recettore FC aspecifico in ciascuna provetta con 1 microlitro di anticorpo CD16/32 anti-topo per 1 x 106 cellule per 10 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione bloccante, aggiungere il cocktail di anticorpi di interesse alle cellule con pipettaggio delicato per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Quindi, lavare le cellule due volte in un volume finale di 4 millilitri di PBS e FBS. Etichettare le cellule con un anticorpo secondario appropriato per altri 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce, seguiti da 2 lavaggi in PBS e FBS, e caricare la provetta del campione sul citometro a flusso.