JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscience
0 visualizzazioni • 3:29 min. • August 7th, 2025
Inizia con un ratto anestetizzato posizionato su un fianco con la coda esposta.
Localizzare la vena caudale laterale, identificare un sito di iniezione lungo la sua lunghezza e disinfettare l'area.
Applicare una leggera pressione sopra il sito di iniezione per dilatare la vena.
Assumere una siringa contenente il virus adeno-associato ricombinante o il vettore AAV che trasporta il gene bersaglio.
Allineare l'ago con la vena e perforare la pelle della coda.
Rilasciare la pressione sulla vena per ripristinare il normale flusso sanguigno.
Inserire l'ago nella vena caudale e iniettare lentamente il virus.
Dopo l'iniezione, ritirare l'ago, applicare pressione per fermare l'eventuale sanguinamento e monitorare il recupero del ratto.
La vena laterale della coda trasporta il virus nel flusso sanguigno, dove circola attraverso il cuore ed entra nel cervello, raggiungendo i neuroni.
All'interno del neurone, il virus entra nel nucleo, rilascia il suo materiale genetico e facilita la produzione di proteine bersaglio per applicazioni neuroterapeutiche.
Anestetizzare correttamente il ratto utilizzando il sistema di anestesia. Garantire un adeguato piano di anestesia grazie all'assenza di una reazione a un pizzicamento delle dita. Quindi, posiziona il ratto nell'area di lavoro su un lato e mantieni l'anestesia usando il cono del naso. Con il ratto sdraiato su un fianco, una vena laterale della coda dovrebbe essere rivolta verso l'alto.
Il sito di iniezione si trova a due terzi della lunghezza della coda. Pulire il sito di iniezione con il tampone per la preparazione dell'alcol. Tenere saldamente la coda leggermente sopra l'area di iniezione con un dito direttamente sopra la vena caudale laterale. Questo dilata la vena. Con lo smusso rivolto verso l'alto, allineare l'ago con la vena della coda visibile nella stessa direzione.
Forare la pelle sopra la vena caudale facendo molta attenzione a evitare che l'altra mano tenga la coda e prema sulla vena caudale . Rilasciare la pressione dalla vena caudale per consentire il normale flusso sanguigno. Quindi sposta l'ago nella vena. Per assicurarsi che l'ago abbia perforato la vena caudale, tirare leggermente indietro lo stantuffo. Se l'ago è nella vena, il sangue scorrerà nell'ago.
Dopo aver riposizionato l'ago, se necessario, stabilizzare l'ago tenendo l'estremità della siringa contro la coda. Iniettare lentamente il vettore nella coda a circa 20 microlitri al secondo.
In caso di iniezione insufficiente, l'animale verrà trasdotto solo parzialmente e i risultati probabilmente non saranno utili. Tuttavia, con la pratica, le buone iniezioni sono molto riproducibili e affidabili.
Se il vettore è stato somministrato, rimuovere l'ago dalla coda e premere una garza contro il sito di iniezione per aiutare ad arginare l'emorragia per 30-60 secondi. Spegnere l'anestesia con isoflurano e l'ossigeno. Monitora il ratto fino a quando non riprende conoscenza e poi rimettilo nella sua gabbia. Smaltire i materiali che potrebbero essere contaminati da AAV in un contenitore appropriato per il rischio biologico e pulire la postazione di lavoro con etanolo al 70%.