Name: Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando lamplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri il metodo CLas-DETECTR per la diagnosi rapida di Huanglongbing negli agrumi utilizzando l'amplificazione con polimerasi ricombinasi e CRISPR-Cas12a. Questa tecnica sensibile rileva Candidatus Liberibacter asiaticus in 90 minuti sul campo.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal National Key R & S Program of China (2021YFD1400805), dal Major Science and Technology R & S Program della provincia di Jiangxi (20194ABC28007), dai progetti del Dipartimento dell'istruzione di Jiangxi (GJJ201449) e dall'innovazione collaborativa della moderna ricerca scientifica agricola nella provincia di Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2)-003).

1. Costruzione del CLas-DETECTR
NOTA: La costruzione di CLas-DETECTR è un processo in quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e visualizzazione dei risultati. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.
<ol><li>Preparazione della soluzione<ol><li>Preparare il tampone A: 20 mM NaOH in PEG 200 al 6%. Per 100 ml, aggiungere 113 mg di NaOH e 6 g di PEG 200 in 80 ml di H2O in un flacone. Incubare il flacone a bagnomaria a 60 °C fino a quando tutto il PEG 200 è sciolto. Quindi, aggiungere H2O a un volume di 100 ml.</li>
		<li>Preparare la soluzione B: Per ogni reazione, aggiungere 10 μL di tampone RPA, 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di R-RPA-RNRr e 3,9 μL di ddH2O ad un volume finale di 15,5 μL. NOTA: F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr sono i primer utilizzati nel test contro il gene nrdB . Vedere la tabella 1 per la sequenza.</li>
		<li>Preparare la soluzione C: Per ogni reazione, aggiungere 1 μL di ssDNA reporter, 3 μL di tampone NEB 3.1, 1 μL di crRNA, 4 μL di Cas12a e 11 μL di ddH2O ad un volume finale di 20 μL. NOTA: Se vi sono molti campioni da rilevare, effettuare un grande volume di soluzione B e soluzione C e aliquote in seguito.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento totale del DNA degli agrumi NOTA: Per risparmiare tempo e rendere questo metodo adatto per la rilevazione di CLas di campo, è stato utilizzato l'approccio basato sul glicole polietilenico alcalino (PEG) per ottenere estratti vegetali grezzi per l'amplificazione del DNA22,23<ol><li>Le foglie di agrumi sono state utilizzate in questo protocollo. Per prima cosa, punzona, punzonate cinque dischi fogliari da una foglia. Quindi, inserire i dischi fogliari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere 200 μL di tampone A. NOTA: Sul campo, pulire prima le foglie se c'è polvere che le copre. I dischi fogliari possono essere tagliati utilizzando il coperchio del tubo da 1,5 ml per evitare la contaminazione incrociata. Altri tessuti di agrumi, come radici, steli, frutti e fiori, possono anche essere utilizzati in questo protocollo.</li>
		<li>Macinare manualmente i dischi fogliari fino a lisci con un'asta di plastica.</li>
		<li>Lasciare il tubo indisturbato per 10 minuti. Quindi, utilizzare il surnatante per l'amplificazione del DNA. NOTA: Il test può essere messo in pausa qui e gli estratti vegetali grezzi estratti con il metodo alcalino-PEG possono essere conservati a -20 °C per almeno 1 anno. Gli alberi di Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) mostrati nel video sono stati coltivati in un vaso riempito con un mix di 9/3/1 (v / v / v) terreno di torba / vermiculite / perlite e mantenuto in una serra situata nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. Gli alberi infetti da HLB sono stati inoculati mediante innesto con gemme Newhall CLas-positive. Gli alberi infetti da HLB e non infetti da HLB sono stati confermati dalla PCR. La CLas è stata rilevata utilizzando la coppia di primer (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) mirata al gene marcatore specifico CLas nrdB. D'altra parte, i sintomi caratteristici di HLB, la chiazza macchiata e le foglie ingiallite possono essere trovati su CLas-positivi ma non su alberi CLas-negativi.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificazione isotermica del DNA<ol><li>Aggiungere 1 μL di surnatante della fase 1.2.3 e 1 μL di MgOAc (concentrazione finale di 14 mM) nella soluzione B e mescolare bene.</li>
		<li>In laboratorio, incubarli in una semplice incubatrice a 37 °C per 15 minuti. NOTA: Sul campo, tenere i tubi in mano per 15 minuti. Si consiglia inoltre di incubare i tubi in un semplice incubatore a 37 °C per 15 minuti se le condizioni lo consentono.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualizzazione dei risultati<ol><li>Aggiungere 10 μL della miscela del punto 1.3.2 nella soluzione C e mescolare bene.</li>
		<li>Incubarli in un'incubatrice a 37 °C per 60 minuti.</li>
		<li>Indossare occhiali e osservare il segnale di fluorescenza verde rilasciato dal reporter ssDNA etichettato con 5' 6-Fluoresceina a 5' e il quencher di fluorescenza a 3' attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile (lunghezza d'onda di eccitazione: 440 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500 nm). NOTA: il segnale di fluorescenza verde può durare diversi giorni, è meglio ATTENZIONE: La luce emessa dal dispositivo di rilevazione a fluorescenza è dannosa per gli occhi. Assicurati di indossare occhiali prima di osservare i risultati.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Test di specificità
NOTA: Per testare la specificità di CLas-DETECTR, il batterio della rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato in laboratorio24 sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR.
NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) non può essere coltivato. Si può ottenere DNA CLas solo dall'estrazione di DNA genomico da tessuti di agrumi infettati da CLas. Xcc è l'agente causale di un'altra importante malattia degli agrumi, il cancro degli agrumi. Burkholderia stabilis ceppo 1440 è un batterio anti-Xcc isolato in laboratorio. Pertanto, sono stati utilizzati ceppi puri per tutti e tre questi batteri.
<ol><li>Estrarre il DNA genomico batterico (gDNA) utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico batterico seguendo il protocollo del produttore. Usa l'acqua come controllo negativo.</li>
	<li>Eseguire la PCR utilizzando strisce tubolari PCR da 0,2 ml con cappucci ottici in una miscela di reazione da 25 μL contenente 1 μL di F-RPA-RNRf, 1 μL di R-RPA-RNRr, 12,5 μL di Ex Taq Versione 2.0 più colorante, 1 μL di modello di DNA e 9,5 μL di H2O.<ol><li>Utilizzare le seguenti condizioni di reazione del ciclo termico: 1 min a 98 °C; seguiti da 35 cicli di 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C, 15 s a 72 °C; poi 10 min a 72 °C; e tenere a 16 °C.</li>
		<li>Eseguire i prodotti PCR su gel di agarosio all'1% a 120 V per 15 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la qPCR in una miscela di reazione da 20 μL contenente 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di R-RPA-RNRr, 10 μL di 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL del modello di DNA e 7,4 μL di H2O.<ol><li>Utilizzare le seguenti condizioni di reazione del ciclo termico: 30 s a 95 °C; seguiti da 45 cicli di 5 s a 95 °C e 32 s a 60 °C; e poi uno stadio di curva di fusione di 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C.</li>
		<li>Includi tre ripetizioni tecniche in ogni ripetizione.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire il metodo CLas-DETECTR seguendo i passaggi da 1.1 a 1.4.</li>
</ol>3. Confronto della sensibilità
<ol><li>Per testare la sensibilità di CLas DETECTR, rilevare una serie di diluizioni di frammenti di DNA CLas utilizzando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, come descritto sopra.</li>
	<li>Amplificare un segmento di DNA con una lunghezza di 1.060 bp da nrdB utilizzando il primer set F-RNR e R-RNR in una miscela di reazione da 100 μL contenente 4 μL di F-RNR, 4 μL di R-RNR, 50 μL di PrimeSTAR Max Premix, 2 μL di DNA template e 40 μL di H2O, seguendo le condizioni di reazione del ciclo termico (30 s a 98 °C; seguiti da 35 cicli di 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; poi 10 min a 72 °C; e tenere a 16 °C). NOTA: Il gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-) è specifico per CLas21. Si può facilmente ottenere l'amplicone nrdB dal gDNA di agrumi CLas-positivo usando il primer set F-RNR e R-RNR. Il primer set F-RNR e R-RNR amplifica un frammento nrdB da 1.060 bp, mentre il primer set F-RPA-RNR e R-RPA-RNR amplifica un frammento di 104 bp del gene nrdB, che è la parte del frammento nrdB da 1.060 bp.</li>
	<li>Purificare i prodotti PCR con un kit di estrazione del gel di DNA seguendo il manuale del produttore.</li>
	<li>Diluire i prodotti PCR contenenti gli ampliconi nrdB con ddH2O sterilizzato.</li>
	<li>Calcola il numero di copie del gene nrdB utilizzando il numero di copia del DNA online disponibile in commercio e il calcolatore di diluizione.</li>
	<li>Preparare diluizioni del DNA contenenti 2,01 × 106 copie/μL, 2,01 × 105 copie/μL, 2,01 × 104 copie/μL, 2,01 × 103 copie/μL, 2,01 × 10 2 copie/μL, 2,01 × 101 copie/μL, 2,01 × 100 copie/μL e2,01 × 10−1 copie/μL di frammenti di DNA CLas.</li>
</ol>4. Rilevamento del campione
NOTA: Dopo il test di specificità e sensibilità, il metodo CLas-DETECTR è stato utilizzato per rilevare la presenza di CLas nei campioni di foglie di campo raccolti dagli aranci dolci di Newhall coltivati nel vivaio di risorse di germoplasma nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. È stata eseguita una qPCR per verificare i risultati.
<ol><li>Prova un totale di 15 alberi. Usa l'acqua come controllo negativo.</li>
	<li>Eseguire i metodi CLas-DETECTR e qPCR come descritto in precedenza. NOTA: A causa delle caratteristiche di distribuzione non uniforme delle CLas negli agrumi, le foglie che mostrano sintomi di HLB sono state raccolte in via prioritaria. Se un albero sembrava sano, le foglie sono state raccolte in modo casualeIl sistema CLas-DETECTR funziona correttamente.</li>
</ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questo studio presenta un metodo rapido e portatile per rilevare CLas chiamato CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. CLas-DETECTR rileva CLas con specificità e sensibilità (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, utilizzando campioni di foglie di Newhall, CLas-DETECTR rileva CLas con la stessa sensibilità della qPCR (Figura 4). ...

Huanglongbing (HLB) è una delle malattie degli agrumi più problematiche in tutto il mondo1. L'HLB è causata dai batteri filocolonizzatori e fastidiosi Candidatus Liberibacter spp., tra cui Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. La specie associata all'HLB più diffusa in Cina e negli Stati Uniti è CLas, che viene trasmessa dalle psillidi asiatiche degli agrumi (Diaphorina citri) o attraverso l'innesto3. Dopo essere stati infettati da CLas, gli alberi di agrumi mostrano un declino della crescita fino alla morte2. I sintomi comuni delle foglie di agrumi infettate da CLas sono chiazze chiazzate, isole verdi (piccoli punti circolari verde scuro), vene di sughero sollevate su foglie più spesse e coriacee e germogli ingialliti non uniformi2. Inoltre, i frutti infetti da CLas appaiono piccoli e sbilenchi2.
Poiché nessuna varietà di agrumi è resistente all'HLB e non esiste una cura terapeutica per l'HLB, la prevenzione dell'HLB richiede la quarantena e l'isolamento degli alberi di agrumi CLas-positivi 2,3. Pertanto, la diagnosi precoce è fondamentale per il monitoraggio e la quarantena per prevenire la diffusione di CLas e ridurre al minimo le perdite economiche3. Inoltre, è necessario rilevare CLas sensibili a causa del basso titolo di CLas nelle piante durante la fase iniziale dell'infezione3. In Cina, il rilevamento di CLas viene solitamente condotto da alcuni centri di test certificati. Tuttavia, il processo di rilevamento richiede in genere almeno 1 settimana e la tassa di rilevamento è costosa. Pertanto, per aiutare a monitorare l'incidenza di HLB
Varie tecnologie sono state applicate per diagnosticare HLB 4,5,6,7,8,9. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR quantitativa (qPCR) sono gli strumenti più utilizzati per la rilevazione di CLas grazie alla loro elevata sensibilità e specificità 4,5. Tuttavia, queste tecnologie si basano fortemente su strumenti costosi e personale altamente qualificato. Inoltre, diversi metodi di amplificazione isotermica, come l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), sono stati sviluppati come alternative interessanti ai metodi PCR convenzionali grazie alla loro semplicità, rapidità e basso costo 8,9,10. Tuttavia, è difficile applicarli per rilevare con precisione i CLas a causa dei segnali di amplificazione non specifici, che possono causare risultati falsi positivi.
Il rilevamento dell'acido nucleico basato su endonucleasi CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) guidato da RNA è stato sviluppato come tecnologia di diagnostica molecolare di nuova generazione grazie alla sua elevata sensibilità, specificità e affidabilità11,12,13,14. Queste tecnologie diagnostiche CRISPR/Cas si basano sull'attività di nucleasi collaterale delle proteine Cas per scindere il DNA a singolo filamento (ssDNA) modificato con un reporter fluorescente e un quencher di fluorescenza a ciascuna estremità degli oligonucleotidi, nonché un dispositivo di rilevamento della fluorescenza per catturare il reporter fluorescente rilasciato11,12 . L'attività nucleasica di diversi effettori Cas attivati dal duplex bersaglio dell'RNA CRISPR (crRNA) può scindere indiscriminatamente il circostante ssDNA11 non bersaglio. CRISPR-Cas12a (chiamato anche Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas di classe 2 di tipo V-A, dimostra diversi vantaggi rispetto a Cas9, come una minore tolleranza al mismatch e una maggiore specificità13. Il sistema Cas12a/crRNA è stato applicato per la rilevazione sensibile e specifica degli acidi nucleici di patogeni umani e fitopatogeni 14,15,16,17,18. Pertanto, l'utilizzo del sistema Cas12a/crRNA dovrebbe consentire la rilevazione accurata e sensibile dell'acido nucleico di CLas.
Cas12a da solo non è teoricamente abbastanza sensibile da rilevare bassi livelli di acidi nucleici. Pertanto, per migliorare la sua sensibilità di rilevamento, il rilevamento CRISPR-Cas12a è tipicamente combinato con un passo di amplificazione isoterma14,15. L'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) consente un'amplificazione del DNA isoterma sensibile e rapida in un intervallo di temperatura da 37 °C a 42 °C19.
Una piattaforma di rilevamento chiamata DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) che combina l'attività DNasi di Cas12a con RPA e una lettura della fluorescenza è stata recentemente ideata12 e ha dimostrato di rilevare l'acido nucleico con una maggiore sensibilità20. Inoltre, il segnale di fluorescenza emesso dai campioni positivi può essere osservato attraverso un dispositivo portatile di rilevamento della fluorescenza sul campo.
Poiché abbiamo amplificato il DNA con RPA, progettato crRNA mirato al gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-subunità) a cinque copie specifico di CLas21 e impiegato l'attività DNasi della proteina Cas12a, abbiamo chiamato questo metodo di rilevamento CLas CLas-DETECTR. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas esistenti, CLas-DETECTR è veloce, accurato, sensibile e implementabile.

<table><tbody><tr><td>Kit di estrazione del gel di DNA AxyPrep</td><td>Corning</td><td>09319KE1</td><td>Cina</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA genomico batterico</td><td>Solarbio</td><td>D1600</td><td>Cina</td></tr><tr><td>EnGen LbCas12a&nbsp;</td><td>TOLOBIO</td><td>32104-01</td><td>Cina</td></tr><tr><td>Ex Taq Versione 2.0 più colorante</td><td>TaKaRa</td><td>RR902A</td><td>Cina</td></tr><tr><td>Dispositivo di rilevamento fluorescente portatile&nbsp;</td><td>LUYOR</td><td>3415RG</td><td></td></tr><tr><td>Cina Perforatrice&nbsp;</td><td>Deli</td><td>114</td><td>Cina</td></tr><tr><td>Acetato di magnesio, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Regno Unito</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SCR</td><td>10019718</td><td>Cina</td></tr><tr><td>NEB tampone 3.1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7203</td><td>USA</td></tr><tr><td>Provette per strisce PCR</td><td>LABSELECT</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>Cina</td></tr><tr><td>PEG 200&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3015</td><td>USA</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td><td>TaKaRa</td><td>R045A</td><td>Cina</td></tr><tr><td>Caricamento rapido Viola 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0550S</td><td>USA</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820B</td><td>China</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Regno Unito</td></tr></tbody></table>

rilevamento di candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con crispr-cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

La diagnosi precoce di Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) da parte degli agrumicoltori facilita l'intervento precoce e previene la diffusione della malattia. Qui viene presentato un semplice metodo per la diagnosi rapida e portatile di Huanglongbing (HLB) che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e un reporter fluorescente che utilizza l'attività nucleasica del sistema 12a (CRISPR-Cas12a) associato a CRISPR regolarmente intervallato. La sensibilità di questa tecnica è molto più alta della PCR. Inoltre, questo metodo ha mostrato risultati simili alla qPCR quando sono stati utilizzati campioni di foglie. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas convenzionali, il metodo di rilevamento qui presentato può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica che non richiede l'uso di macchine PCR. Inoltre, i risultati possono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo.

Qui, abbiamo descritto una piattaforma portatile, CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a per diagnosticare HLB sul campo. Lo schema di CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.
Quando campioni di foglie provenienti dagli alberi di Newhall infetti da HLB e non infetti da HLB (Figura 1B), per i quali la presenza di CLas è stata confermata dalla PCR (Figura 1C), sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR, è stato osservato un segnale di fluorescenza...

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abbreviato in HLB. È una malattia degli agrumi devastante in tutto il mondo. Nei paesi più produttori di agrumi, come la Cina e gli Stati Uniti, l'HLB è causata dal batterio limitato al floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abbreviato in CLas.La diagnosi precoce delle CLa è stata importante per i coltivatori che facilitano l'intervento precoce e prevengono la diffusione della malattia. Quindi qui abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la diagnosi rapida e portatile di HLB, combinato con l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e il sistema CRISPR-Cas12a. L'abbiamo chiamato CLas-DETECTR.La sensibilità della nostra piattaforma è molto più alta della PCR. Inoltre, mostra risultati simili con qPCR quando sono stati utilizzati i campioni di foglie. Confronta con i rilevamenti CLas convenzionali, il nostro metodo può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica.Il risultato può anche essere visualizzato attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo. Il CLas-DETECTR contiene quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e risultati della visualizzazione. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato qui.Il buffer A, la soluzione B e la soluzione C vengono preparati come descritto nel protocollo. Per risparmiare tempo e rendere questo metodo adatto per il rilevamento di CLas sul campo, è stato utilizzato l'approccio basato sul glicole polietilenico E.coli per ottenere estratti vegetali grezzi per l'amplificazione del DNA. Le foglie di agrumi sono utilizzate nello strumento.Perforare i pochi pezzi di dischi fogliari dalla foglia. Mettere i dischi fogliari in un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di Buffer A nel tubo.Macinare manualmente i dischi fogliari fino a lisci con un'asta di plastica. Lasciare il tubo indisturbato per 10 minuti. Il surnatante viene successivamente applicato all'amplificazione del DNA.Per l'amplificazione isotermica del DNA, aggiungere un microlitro di surnatante dal punto 2.3 e un microlitro di acetato di magnesio nella soluzione B e mescolare bene. In laboratorio, incubarli in una semplice incubatrice a 37 gradi per 15 minuti. Per visualizzare i risultati, aggiungere 10 microlitri della miscela dal punto 3.2 nella soluzione C e mescolare bene.Incubali nell'incubatore a 37 gradi per 60 minuti. Indossare una maschera e osservare il segnale di fluorescenza verde attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile. Per testare la specificità di CLas-DETECTR, prime colonie pure di Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.Citri, che è il patogeno del cancro degli agrumi, e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato nel nostro laboratorio sono stati utilizzati per estrarre il loro DNA genomico. Quindi questo DNA genomico di tre batteri e il DNA genomico delle foglie di Newhall CLas-positive sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR. Per testare la sensibilità di CLas-DETECTR, sono state rilevate una serie di diluizioni di frammenti di DNA CLas utilizzando PCR, CLas-DETECTR e qPCR come descritto nel protocollo Dopo la specificità e il test di sensibilità, è stato utilizzato il metodo CLas-DETECTR per rilevare la presenza di CLas in campo.Campioni di foglie raccolti dall'albero di arancio dolce di Newhall coltivato nel vivaio di risorse di germoplasma nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. È stato applicato anche qPCR, un convincente metodo di rilevamento CLas solitamente utilizzato in laboratorio. I campioni di foglie dell'albero Newhall infetto da HLB e non infetto da HLB, in cui è stata confermata la presenza di CLas nel nostro laboratorio, sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR.Il segnale di fluorescenza verde è stato catturato nel campione infetto da HLB, ma non nel controllo HLB-non infetto e negativo. Abbiamo determinato la specificità di CLas-DETECTR utilizzando acidi nucleici estratti da altri batteri. Nel test CLas-DETECTR, solo il gDNA estratto dalle foglie di Newhall CLas-positive ha dimostrato segnali fluorescenti verdi.Il gDNA estratto da Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri e Burkholderia stabilis ceppo 1440 non lo ha fatto, il che significa che CLas-DETECTR può rilevare CLas in modo specifico. Abbiamo anche testato la sensibilità di CLas-DETECTR utilizzando una serie di diluizioni del DNA CLas, elencate nel protocollo.La PCR può rilevare 201 copie per megalitro. D'altra parte, CLas-DETECTR può rilevare 2,01 copie per megalitro, suggerendo la sua disponibilità come diagnostica di campo sensibile. qPCR può rilevare 0,201 copie per megalitro e il valore Ct è superiore a 36.Quindi CLas-DETECTR è due ordini di grandezza più sensibile della PCR tradizionale e un ordine di grandezza meno sensibile della qPCR quando sono stati utilizzati ampliconi specifici CLas diluiti. Infine, ha riesaminato la fattibilità del CLas-DETECTR per i campioni sul campo e ha confrontato la sua sensibilità con la qPCR. In cifre, vediamo.Possiamo vedere che il valore Ct è superiore a 36 quando la concentrazione di CLas è inferiore a 0,2 copie per megalitro, che è una concentrazione molto bassa. Tra i 15 campioni, il valore Ct dei campioni 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 rilevati da qPCR era inferiore a 36. È stato osservato un apparente segnale di fluorescenza verde.D'altra parte, quando il valore Ct dei campioni 6, 7, 9, 12 e 15 rilevati da qPCR era indeterminato, non è stato osservato alcun segnale fluorescente verde. Inoltre, sono stati osservati deboli segnali fluorescenti verdi quando il valore CT dei campioni 5 e 11 rilevati dalla qPCR era superiore a 36. I risultati suggeriscono che la nostra piattaforma è uno strumento rapido, robusto e sensibile per la diagnosi HLB sul campo.

field-deployable-candidatus-liberibacter-asiaticus-detection-using

Research

JoVE Journal

Biology

I sistemi CRISPR-Cas e le proteine anti-CRISPR sono stati integrati nello schema delle porte booleane in Saccharomyces cerevisiae. I nuovi piccoli circuiti logici hanno mostrato buone prestazioni e approfondito la comprensione sia dei fattori di trascrizione basati su dCas9/dCas12a che delle proprietà delle proteine anti-CRISPR.

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Presentiamo un protocollo che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi con un sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA e costruisce una microscopia portatile per smartphone con una classificazione assistita dall'intelligenza artificiale per il rilevamento di virus a DNA point-of-care.

Sistema di rilevamento del virus del DNA basato su RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e Deep Learning

Qui, presentiamo la preparazione passo dopo passo dell'amplificazione isotermica premiscelata e liofilizzata basata sulla ricombinasi e delle reazioni basate su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), che possono essere utilizzate per il rilevamento di biomarcatori di acidi nucleici di patogeni di malattie infettive o altri marcatori genetici di interesse.

Diagnostica point-of-care basata su CRISPR con reagenti premiscelati e liofilizzati

Per facilitare la rilevazione rapida e precisa di Acinetobacter baumannii, presentiamo un protocollo che impiega l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) in combinazione con l'endonucleasi LbaCas12a per identificare le infezioni da A. baumannii.

Rilevamento rapido e specifico delle infezioni da Acinetobacter baumannii utilizzando un sistema basato su amplificazione della polimerasi ricombinasi/Cas12a

In questo protocollo, viene illustrato un saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinasi CRISPR/Cas12a per la rilevazione del patogeno invasivo delle piante, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinata CRISPR/Cas12a per il rilevamento di Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Qui, descriviamo una procedura semplice e rapida per rilevare il DNA da agenti patogeni delle api, come Lotmaria passim e Nosema ceranae, utilizzando una lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e i saggi CRISPR/Cas12a.

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Questo video mostra le tecniche per l'etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

L'avvento di un determinato sito ricombinasi (SSR), la tecnologia e la Cre / lox sistema ha portato a numerosi progressi nel campo della biologia molecolare, ed ha dimostrato di essere un prezioso strumento per valutare la funzione dei geni negli animali transgenici. Questa intervista discute il meccanismo di ricombinazione site specific di ciclizzazione ricombinasi (Cre) e come l'utilizzo di questo enzima ha portato allo sviluppo di mutagenesi condizionale, che ha vantaggi significativi...

Principi di Site-Specific ricombinasi (SSR) Tecnologia

Qui riportiamo la generazione di Tre ricombinasi attraverso la regia, l'evoluzione molecolare. Tre ricombinasi riconosce un pre-definito sequenza bersaglio all'interno della sequenza LTR di HIV-1 provirus, con la conseguente escissione e l'eradicazione del provirus infette da cellule umane. Mentre ancora nella sua infanzia, per la regia evoluzione molecolare consentirà la creazione di enzimi personalizzati che fungeranno da strumenti di chirurgia molecolare e medicina molecolare.

Evoluzione molecolare del ricombinasi Tre

Corrente di HIV-1 strategie agire per sopprimere il ciclo di vita virale, ma non in modo efficace sradicare l'infezione. In questo studio dimostriamo che una ricombinasi progettato può DNA in modo efficiente accise integrati di HIV-1 provirale dal genoma delle cellule infette.

Intervista: HIV-1 DNA provirale escissione Utilizzando un ricombinasi Evolved

Scopri il metodo CLas-DETECTR per la diagnosi rapida di Huanglongbing negli agrumi utilizzando l'amplificazione con polimerasi ricombinasi e CRISPR-Cas12a. Questa tecnica sensibile rileva Candidatus Liberibacter asiaticus in 90 minuti sul campo.

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando lamplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a (Video) | JoVE Journal

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

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