Name: Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare lespressione genica nei mammiferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Scopri l'ottimizzazione dell'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule HEK293T utilizzando lo strumento optogenetico LACE. Questo metodo ad alto rendimento migliora il controllo dell'espressione genica nei mammiferi.

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<table><tbody><tr><td>Tubi microcentrifughe da 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti da 10 mL</td><td>VWR</td><td>77395-252</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 mL</td><td>VWR</td><td>75816-100</td><td></td></tr><tr><td>1000 & mu; Punte filtro a L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; Tubi centrifughe ad alte prestazioni, tappo piatto</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di potenza ottica 1931-C</td><td>Newport</td><td>1931-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 2 mL</td><td>VWR</td><td>75816-104</td><td></td></tr><tr><td>20 & mu; Punte filtro a L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; Punte filtro a L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>Tubi centrifughe ad alte prestazioni da 50 mL, tappo piatto</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a V a 96 pozzi</td><td>MARCHplate</td><td>781661</td><td></td></tr><tr><td>A21, lampadina LED rossa</td><td>Lampadine Bluex</td><td>N/A</td><td>Sorgente di luce rossa</td></tr><tr><td>Arduino IDE Software</td><td>Arduino</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza, Classe II</td><td>NuAire</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro a linea luminosa</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Slide di conteggio delle celle</td><td>BioRad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura cellulare a 96 pozzi, piastra inferiore in vetro #1.5H</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Pronti all'Uso Quotidiano delle Fluorosfere QC</td><td>Beckman Coulter</td><td>C65719</td><td>4 & deg; C</td></tr><tr><td>CytoFLEX-S Flow Cytometro (4 canali viola, 2 blu, 4 gialli verdi, 3 rossi)</td><td>Beckman Coulter</td><td>C09766</td><td></td></tr><tr><td>Polvere salina tamponata con fosfato di Dulbecco, senza calico, senza magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600069</td><td>Temperatura Ambiente</td></tr><tr><td>Centrifuga Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 022622501</td><td>Passo centrifuga a piastra inferiore a V</td></tr><tr><td>Centrifuga Eppendorf 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, 8-canali, volume variabile, 30 - 300 & mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, single-channel, volume variabile, 100 - 1000 & mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, single-channel, volume variabile, 2 - 20 & mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, single-channel, volume variabile, 20 - 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Nastro di etichettatura da laboratorio a uso generale</td><td>VWR</td><td>89097-920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Gibco, polvere, glucosio alto</td><td>Fisher Scientific</td><td>12100061</td><td>4 & deg; C</td></tr><tr><td>Gibco Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td>Temperatura Ambiente</td></tr><tr><td>FBS Gibco Value Heat Inattivato</td><td>Fisher Scientific</td><td>A5256901</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Gibco, Tripsina-EDTA (0,05%), con EDTA, Origine Animale, 1X, Fenolo Rosso, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>HEK293T Celle</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>-80 &deg; C, azoto liquido</td></tr><tr><td>Marcatori di laboratorio, Micronova</td><td>VWR</td><td>89205-944</td><td></td></tr><tr><td>Lampada da scrivania in metallo</td><td>Design Semplici</td><td>N/A</td><td>Lampada per la luce rossa</td></tr><tr><td>OptoPlate-96</td><td>LABmaker</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XP per aiuti di pipette</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide: CIBN-gRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Plasmide: CMV-eGFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Plasmide: CRY2-eGFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione in vitro del DNA di PolyJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1536117</td><td>4 & deg; C</td></tr><tr><td>Fiaschetta di coltura cellulare T-75</td><td>VWR</td><td>10062-860</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO2 con camicia d'acqua</td><td>VWR</td><td>10810-884</td><td></td></tr></tbody></table>

rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

Rapid Optimization of a Light-Inducible System to Control Mammalian Gene Expression

Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

Inducible gene expression tools can open novel applications in human health and biotechnology, but current options are often expensive, difficult to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Questo video dimostra il sistema di espressione genica della tetraciclina, o Tet-On, in un modello murino. In presenza di doxiciclina, un derivato della tetraciclina, il sistema Tet-On costituito da una proteina transattivatrice controllata da tetraciclina inversa si attiva ed esprime il gene di interesse.

Espressione genica basata su un sistema regolabile inducibile Tet-On in vivo: un sistema di espressione genica indotta da tetraciclina per l'attivazione della trascrizione genica bersaglio in un modello murino

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per la rapida costruzione di fattori di trascrizione artificiali (ATF) con i reporter GFP cognate e la quantificazione della capacità ATF di stimolare l'espressione della GFP mediante citometria a flusso.

Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

Il metodo qui descritto viene utilizzato per indurre la cascata di segnalazione apoptotica a passi definiti al fine di sezionare l'attività di una proteina effettrice batterica anti-apoptotica. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'espressione inducibile di proteine pro-apoptotiche o tossiche, o per l'interferenza di dissezione con altre vie di segnalazione.

L&#39;applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

Questo protocollo descrive una strategia optogenetica per modulare l'attivazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) durante la differenziazione cellulare e lo sviluppo embrionale di Xenopus . Questo metodo consente l'attivazione reversibile del percorso di segnalazione MAPK nella coltura di cellule di mammiferi e negli organismi vivi multicellulari, come gli embrioni di Xenopus , con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Modulazione reversibile mediata dalla luce del percorso proteico di kinasi attivato da Mitogen durante la differenziazione cellulare e<em&gt; Xenopus</em&gt; Sviluppo embrionale

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.

Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120

La bioluminescenza - la luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di piccole molecole, una luciferina - può essere sfruttata per attivare le proteine fotosensoriali, aggiungendo così un'altra dimensione alla stimolazione della luce e consentendo la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule attraverso scale temporali e spaziali.

Optogenetica bioluminescente 2.0: sfruttare la bioluminescenza per attivare proteine fotosensoriali in vitro e in vivo

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Scopri l'ottimizzazione dell'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule HEK293T utilizzando lo strumento optogenetico LACE. Questo metodo ad alto rendimento migliora il controllo dell'espressione genica nei mammiferi.

Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

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