Name: Purificazione efficiente dei polipeptidi simili allelastina (ELP) da E. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Scopri la purificazione rapida dei polipeptidi simili all'elastina (ELP) da Escherichia coli mediante estrazione con solvente organico. Questo metodo efficiente preserva l'attività delle proteine di fusione e garantisce bassi livelli di endotossine per applicazioni biomediche.

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<ol><li>Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides%3A+therapeutic+applications+for+an+emerging+class+of+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines.</a> J Control Release. 240, 93-108 (2016).</li>
<li>MacEwan, S. R., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery.</a> J Control Release. 190, 314-330 (2014).</li>
<li>Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+elastin-like+polypeptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery.</a> Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targeting+of+immunosuppressants+using+a+bifunctional+elastin-like+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide.</a> Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally+responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides.</a> Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+purification+of+elastin-like+polypeptides+directly+from+whole+cells+and+cell+lysates+by+organic+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction.</a> Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).</li>
<li>Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fast+organic+extraction-precipitation+method+for+improved+purification+of+elastin-like+polypeptides+that+is+independent+of+sequence+and+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).</li>
<li>Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+mechanism+of+elastin-like+polypeptide-enzyme+fusion+stabilization+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents.</a> Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+elastin-like+polypeptides+and+their+applications+in+drug+delivery+system+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair.</a> J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).</li>
<li>Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bioengineered+elastin-like+polypeptide-based+system+for+targeted+gene+delivery+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells.</a> Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).</li>
<li>Clement, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+the+recombinant+expression+and+chemical+synthesis+of+a+short+cysteine-rich+insecticidal+spider+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Venom+Anim+Toxins+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide.</a> J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).</li>
<li>Miranda, L. P., Alewood, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+chemical+synthesis+of+peptides+and+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).</li>
<li>Eweje, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+nanoparticles+for+cytosolic+delivery+of+nucleic+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins.</a> Nat Biotechnol. , (2025).</li>
<li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+purification+by+organic+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein purification by organic extraction.</a> Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).</li>
<li>Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+elastin-like+polypeptide-based+nucleic+acid+delivery+system+targeted+to+EGFR%2B+bladder+cancer+cells+using+a+layer-by-layer+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach.</a> Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).</li>
<li>Christensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+order+controls+expression+level+and+activity+of+elastin-like+polypeptide+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins.</a> Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrilammide/Bis-acrilammide</td><td>TCI</td><td>A3218</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Bio-Oro Biotecnologia</td><td>A-301-25</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>APS (Persolfato di Ammonio)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Butanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L13171</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>BP118-500</td><td>Componente del buffer di lisi</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Decon Labs</td><td>UN1170</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Acetato di etil</td><td>Fisher Scientific</td><td>E195</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Prodotti di Ricerca Internazionale</td><td>G22020-0.5</td><td>Componente Media di Terrific Broth (TB)</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Componente del buffer di lisi</td></tr><tr><td>Tinta istantanea Coomasie</td><td>Abcam</td><td>ab119211</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bio-Oro Biotecnologia</td><td>12481C25</td><td>Componente di espressione proteica</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>K2HPO4 (Monobasico di fosfato di potassio)</td><td>Scienza dei Wards</td><td>470302-246</td><td>Parte 2 Componente Buffer</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasico fosfato di potassio)</td><td>Scienza dei Wards</td><td>470302-254</td><td>Parte 2 Componente Buffer</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Prodotti di Ricerca Internazionale</td><td>P5200-500.0</td><td>Componente Media di Terrific Broth (TB)</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Bio-Oro Biotecnologia</td><td>L-040-1</td><td>Componente del buffer di lisi</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td>Solvente organico</td></tr><tr><td>Buffer di campione nativo</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0738</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Scala delle proteine</td><td>Bio-Oro Biotecnologia</td><td>P008-500</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Tampone a gel risolutivo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610798</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodim Dodecil Solfato (SDS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J18220-36</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Componente del buffer di lisi</td></tr><tr><td>Buffer a gel impilante</td><td>Bio-Rad</td><td>1610799</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>Componente SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>BP-152</td><td>Componente del buffer di lisi</td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Prodotti di Ricerca Internazionale</td><td>T60065-1000.0</td><td>Componente Media di Terrific Broth (TB)</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Prodotti di Ricerca Internazionale</td><td>Y20025-1000.0</td><td>Componente Media di Terrific Broth (TB)</td></tr></tbody></table>

purificazione efficiente dei polipeptidi simili all'elastina (elp) da e. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico

Efficient Purification of Elastin-Like Polypeptides (ELPs) from E. coli Using an Organic Solvent-based Extraction and Precipitation Method

Dopo aver affrontato le fasi finali del protocollo, il passo successivo è la visualizzazione dell'esito estrazione-precipitazione tramite analisi SDS-PAGE e colorazione blu di Coomassie. Quando c'è una fase di lisi prima dell'estrazione organica, dovrebbe essere evidente una banda ELP prominente. Nel caso di ELP-I-Cm2, questa banda appare a 100 kDa (Figura 3A).
Lo screening di diverse combinazioni di solventi organici ha dimostrato efficienze di estrazione variabi...

Purificazione efficiente dei polipeptidi simili all'elastina (ELP) da E. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico

Elastin-like polypeptides (ELP) are engineered biopolymers built from repetitive pentapeptide sequences that mimic motifs found in mammalian tropoelastin. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di...

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

In questo video, dimostriamo la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa per purificare i peptidi da una miscela di lisato proteico digerito. Questi peptidi purificati vengono quindi liofilizzati e conservati per applicazioni a valle. L'analisi dei peptidi può aiutare a comprendere i meccanismi coinvolti nella segnalazione cellulare e nel cancro.

Purificazione dei peptidi: una tecnica basata su RP-HPLC per estrarre peptidi da lisati proteici digeriti

Polipeptidi di elastina-come sono biopolimeri stimolo-sensibile con applicazioni che vanno dalla purificazione della proteina ricombinante per la consegna della droga. Questo protocollo descrive la purificazione e caratterizzazione di polipeptidi elastina-simili e loro peptidi o proteine ​​fusioni da Escherichia coli usando il loro comportamento di transizione di fase temperatura della soluzione critica inferiore come una semplice alternativa alla cromatografia.

Purificazione non-cromatografico di polipeptidi di elastina ricombinante simili e le loro fusioni con Peptidi e Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em

Le tecnologie ricombinanti hanno permesso ai progettisti di materiali di creare nuove proteine artificiali con funzionalità personalizzate per applicazioni di ingegneria tissutale. Ad esempio, le proteine artificiali della matrice extracellulare possono essere progettate per incorporare domini strutturali e biologici derivati da ECM native. Qui, descriviamo la costruzione e la purificazione di proteine aECM contenenti ripetizioni simili all'elastina.

Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Per la pelle Ingegneria dei Tessuti

Il protocollo prevede una metodologia per solubilizzare fango granulare aerobico per estrarre polimeri extracellulari alginato-like (ALE).

Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Qui sono presentati protocolli per la creazione di piccole vescibole unilamellar a base di peptidi in grado di crescere. Per facilitare la produzione vesiculo del peptide della membrana, queste vesciche sono dotate di un sistema di traduzione della trascrizione e del plasmide di codifica dei peptidi.

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

All'interfaccia di solventi organici e acquosi, proteine arofhiliche elastine su misura si assemblano in complesse strutture supramolecolari come vescicoli, fibre e coacervate innescate da parametri ambientali. I protocolli di assemblaggio descritti producono compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) con proprietà regolabili, consentendo l'incapsulamento di vari carichi.

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Il presente protocollo descrive la precipitazione proteica a base solvente in condizioni controllate per il recupero e la purificazione robusti e rapidi dei campioni di proteoma prima della spettrometria di massa.

Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa

Questo articolo descrive una metodologia per sovraesprimere la Nsp15 ricombinante, una nucleasi tossica, in un sistema di espressione C41(DE3), seguita dalla purificazione della proteina marcata utilizzando la cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine tossiche impegnative.

Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli

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