ネガティブ免疫磁気選択:末梢血単核細胞からB細胞を精製する方法

末梢血単核細胞またはPBMC(末梢血単核細胞)には、B細胞、T細胞、ナチュラルキラーまたはNK細胞、および単球が含まれます。B細胞は、感染と戦うために免疫グロブリン分子を産生します。白血病では、これらの細胞は増殖し、異なる臓器に転移します。

B細胞を単離するには、単離されたPBMCの懸濁液から始め、分化クラスター(CD)と呼ばれる特定の細胞表面分子に対する一次抗体混合物を添加します。特異的抗体は、T細胞上のCD-3分子、単球上のCD-14分子、NK細胞上のCD-16分子に結合し、B細胞は標識されないままである。

次に、サンプルを洗浄して、結合していない抗体を取り除きます。二次抗体標識磁性マイクロビーズをサンプルに加えます。二次抗体は、特定の細胞に付着した一次抗体のFC領域に結合します。標識された細胞懸濁液を含むチューブを磁場の影響下に置きます。野外では、磁気的に標識された細胞が移動してチューブ壁に結合し、不要な細胞がネガティブに選択されます。濃縮されたB細胞を含む上清を新しい収集チューブに集めます。

このプロトコルでは、慢性リンパ性白血病患者のPBMCから白血病B細胞の陰性免疫磁気選択を行います。

上清を廃棄し、1,000万個のPBMCを1ミリリットルの分離バッファー(0.1% BSAおよび2ミリモルEDTAを含むPBS)に再懸濁し、pHを7.4に調整します。ここで、CLLリンパ球をPBMC製剤から精製する必要があります。次に、10 μgのマウスモノクローナル抗CD-3、CD-14、およびCD-16一次抗体を添加し、摂氏4度で30分間インキュベートします。

細胞をアイソレーションバッファーで洗浄し、500 gで摂氏4度で5分間遠心分離した後、1000万個のPBMCを1ミリリットルのアイソレーションバッファーに再懸濁します。再懸濁した細胞を、100マイクロリットルの洗浄した磁気ビーズと摂氏4度で30分間インキュベートし、穏やかに再懸濁します。次に、チューブをマグネットホルダーに2分間置き、結合していない細胞を含む上清を5ミリリットルのピペットで新しいチューブに移します。このステップの後、精製されたCLLリンパ球を使用する準備が整います。