グラム陰性菌の内膜画分と外膜画分の分離

構造的

完全性を維持する低密度スクロースに懸濁された、内膜小胞と外膜小胞を含むグラム陰性菌の全膜画分から始めます。

膜小胞を分離するには、高密度および中密度のスクロース溶液を超遠心チューブに順次加えます。

次に、膜画分と低密度スクロースを加えて、不連続なスクロース勾配を作成します。

超遠心分離機は、密度に基づいて小胞を分離します。

密度の低い内膜小胞は、上部に層を形成します。

リポ多糖類とタンパク質が豊富なより密度の高い外膜小胞は、中密度および高密度のスクロース溶液の界面にバンドを形成します。

内膜層を集め、グラジエント溶液を少量残して廃棄します。

次に、外膜層を収集します。

安定化のために各画分に貯蔵バッファーを追加します。

遠心分離して小胞を分離し、上清を除去します。

精製した膜小胞を再懸濁し、均質化し、さらなる分析のために低温で保存します。

スクロース勾配を準備するには、ポリプロピレンまたはウルトラクリアオープントップチューブをわずかに傾けた位置に持ちます。

2ミリリットルの高密度スクロース溶液をゆっくりと加えます。次に、低密度のスクロース溶液を4ミリリットル加えます。密度勾配を調製するときは、層が混ざらないようにスクロース溶液をゆっくりと加えます。

スクロース層はわずかに見え、一般的には定義されているように見えるはずです。次に、以前に1ミリリットルの低密度等密度スクロース溶液に再懸濁した全膜画分を加えます。最後に、約6ミリリットルの低密度等密度スクロース勾配溶液を加えて、チューブの残りの部分を満たします。

ス

イングバケットローターを使用して、288,000倍Gおよび摂氏4度でサンプルを16〜23時間超遠心分離します。P1000ピペットチップの端をポイントから約5ミリリットル切り取ります。遠心分離が完了したら、ピペットを使用してチューブから上部の茶色の層を取り除きます。

内膜画分を含むこの層をポリカーボネートボトルに移して超遠心分離します。53%スクロースと73%スクロースの界面の上に約2ミリリットルのスクロース溶液を残して、下部の白い外膜画分が内膜画分を交差汚染しないようにします。端を取り外したP1000ピペットチップを再度使用し、外膜層を取り除き、ポリカーボネートボトルに移します。

ポリカーボネートボトルの残りの空隙を単離された膜貯蔵バッファーで満たし、反転またはピペッティングで混合します。サンプルを氷上に保持します。メンブレンを回収するには、ポリカーボネートボトルを184,500倍G、摂氏4度で1時間超遠心分離します。

最後に、上清を廃棄し、500〜1,000マイクロリットルの保存バッファーを加えます。Dounce均質化により膜を再懸濁します。サンプルを2本のミリリットル微量遠心チューブに収集します。