一定の培地流量下での初代ヒト内皮細胞への肺炎球菌の付着の評価

マイクロ流体ポンプに接続されたゼラチンでコーティングされたチャネルスライドを顕微鏡ステージに置きます。

スライドには、流動培地下で培養された初代ヒト内皮細胞が含まれており、細胞表面にフォン・ヴィレブランド因子または糖タンパク質であるVWFのストリングが入っています。

これらの文字列は、ヒスタミンで細胞を刺激することによって生成されます。

マイクロ流体ポンプを介して適用される制御された培地の流れは、VWFの分泌と巻き戻しを促進します。これにより、VWF 文字列上の特定のバインディングドメインが公開されます。

培地の流れを停止し、緑色の蛍光色素結合VWF特異的抗体を追加し、フローを再開して文字列に抗体を標識します。

培地の流れを一時停止し、赤色蛍光タンパク質を発現する肺炎球菌を導入します。

流れを再開して細菌を分散させ、表面接着剤を介して露出したドメインへの付着を可能にします。

蛍光顕微鏡を使用して、ストリングへのリアルタイムの細菌結合を視覚化します。

培地の流れを停止し、Zスタック画像を取得して、内皮細胞への細菌の付着を定量化します。

顕微鏡で視覚化するには、流体ユニットを摂氏37度の加熱チャンバーに入れます。チャンネルスライドを予熱した顕微鏡のステージに置きます。

ヒスタミンと細菌をフロー循環に注入する前に、細胞の形態とHUVEC層の完全性を制御します。フロー設定を維持します。灌流チューブ内を循環するECGMS培地に注入ポートを介して136マイクロリットルの100ミリモルヒスタミンストック溶液を注入することにより、内皮生存可能なPalade体からVWFの放出を誘導します。

多量体化VWFストリングの免疫蛍光検出のために、200マイクロリットルのPBSの容量で20マイクログラムのVWF特異的FITC結合抗体を循環する13.6ミリリットルのECGMS培地に注入します。HUVEC細胞表面に生成されたVWFストリングへの肺炎球菌の付着を定量化するには、最大容量1ミリリットルの肺炎球菌を発現するRFPあたり8番目のCFUに1.35倍10を注入ポートを使用してECGMS培地に注入します。顕微鏡倍率用の63倍油浸対物レンズを選択し、顕微鏡ソフトウェアの蛍光フィルター設定を、肺炎球菌を発現するRFPを検出するための540ナノメートル検出フィルターを備えたRFPチャネルに調整します。

VWFストリングへの細菌の付着を定量化するには、形態学的に無傷のHUVECが約10個含まれている少なくとも30の代表的なフィールドビューのZスタックのスナップショットを作成し、肺炎球菌の量をカウントします。