ゼブラフィッシュ幼虫の腸からの クロストリディオイデス・ディフィシル 細菌の単離と培養

まず、病原性嫌気性細菌である クロストリディオイデス・ディフィシルに感染した腸を持つ安楽死させたゼブラフィッシュの幼虫から始めます。

幼虫の上部背側幹を固定し、頭を取り除いて内臓を露出させます。

体幹中央部を固定し、腸を体腔からそっと隔離します。

単離した腸を緩衝液を含む微量遠心チューブに移します。

乳棒を使用して腸を均質化し、組織を破壊し、腸内微生物を放出します。

ホモジネートを抗生物質を添加した選択的飼育培地を含むチューブに移します。

ホモジネートを嫌気性チャンバーでインキュベートします。

嫌気性条件は好気性細菌の増殖を阻害しますが、抗生物質は天然の嫌気性腸内微生物の増殖を特異的に標的にして抑制します。

クロストリディオイデス・ディフィシル はこれらの抗生物質に耐性があり、嫌気性条件下で増殖します。

飼育培地中の栄養素と成長因子は細胞分裂をさらに促進し、生存可能な クロストリジオイデス・ディフィシルの増殖を可能にします。

感染したゼブラフィッシュの幼虫を安楽死させた後、頭に近いゼブラフィッシュの幼虫の背側幹に針を刺してゼブラフィッシュを固定します。ランセットで鰓の後ろの頭を取り除きます。

背側体幹の中央に2本目の針を挿入します。ゼブラフィッシュの腹部に3本目の針を挿入し、腸を体腔から引き抜きます。マイクロインジェクション針を使用して、10〜15個の腸を200マイクロリットルの滅菌1X PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。

乳棒で腸を均質化して組織を破壊し、均質化を調製します。乳棒がチューブの底に到達し、すべての腸を完全に破壊します。ホモジネートに、タウロコール酸の有無にかかわらず、D-シクロセリンおよびセフォキシチンを含むクロストリディオイデス・ディフィシル飼育培地を加え、嫌気性チャンバーでインキュベートします。