グラム陽性菌Bacillus megateriumからのプロトプラストの生成

グラム陽性菌である Bacillus megateriumの培養物を取り上げます。

培養物を新鮮な培地で希釈し、振とうしながらインキュベートして細菌の分裂を促進します。

培養物をチューブに移し、遠心分離して細菌をペレット化します。

上清を除去し、プロトプラストの溶解を防ぐために浸透圧安定剤を含む培地にペレットを再懸濁します。

再懸濁した溶液をフラスコに移し、リゾチームを加え、振とうしながらインキュベートします。

インキュベーション中、リゾチームは細菌の厚いペプチドグリカン細胞壁を分解します。

細胞壁が分解すると、細菌は棒状から原形質膜のみで囲まれた球形体に変化し、プロトプラストを形成します。

懸濁液を顕微鏡で視覚化します。

丸い形の細菌はプロトプラストの形成を確認し、腫れた棒状の細菌は不完全な消化を示します。

溶液をチューブに移し、遠心分離してプロトプラストをペレット化します。

上清を除去し、浸透圧安定剤を含む新鮮な培地にプロトプラストを再懸濁して、さらなる分析を行います。

グラム陽性 B.メガテリウム プロトプラストを調製するには、一晩細菌培養物を250ミリリットルのフラスコで100ミリリットルの3%TSBの100ミリリットルで1対1000の比率で希釈し、摂氏37度で振とうしながら4.5時間インキュベートします。液体培養物が600ナノメートルで0.9〜1.0の光学密度に達したら、細菌を2本の50ミリリットルの円錐形チューブに分割して遠心分離し、シロロジーピペットを使用して上清を吸引します。ペレットをチューブあたり2.5ミリリットルのプロトプラスト培地に再懸濁し、懸濁液を1つの円錐形のチューブに引き込んで125ミリリットルのフラスコで培養します。

1ミリリットルあたり5ミリグラムのリゾチームを培養物に加え、摂氏37度で振とうしながら1時間インキュベートします。光学顕微鏡でプロトプラストの成長を監視し、球体ではなく腫れた棒状に現れる細菌などの不規則性に注意します。インキュベーションの最後に、懸濁液を遠心分離のために15ミリリットルの円錐形チューブに移し、ペレットを5ミリリットルのプロトプラスト培地に再懸濁します。

その後、プロトプラストは摂氏マイナス20度で最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存できます。