腸上皮単層を横切る大 腸菌 のトランスサイトーシスの評価

血流感染症の新生児から分離した 大腸菌 培養から始めます。

遠心分離して細菌をペレット化し、上清を廃棄し、抗生物質を含まない培地にペレットを再懸濁します。

腸上皮細胞単層を含むトランスウェルインサートを備えたプレートを取ります。

プローブを使用してセル層全体の電気抵抗を測定し、単層の完全性を確認します。

細菌懸濁液をインサートに加え、インキュベートします。

細菌は上皮細胞に付着し、小胞内で内在化され、トランスサイトーシスと呼ばれるプロセスを介して細胞を横切って下井戸に輸送されます。

電気抵抗を再度測定します。安定した値は、トランスサイトーシス中の無傷の単層を確認します。

インサートを新しいウェルに移し、前の下部ウェルから培地を回収します。

収集した培地を寒天プレートにプレートし、インキュベートして細菌コロニーを発達させます。

コロニーを数えて、腸上皮関門を横切る 大腸菌 トランスサイトーシスの程度を決定します。

接種後 30 分ごとに、抗生物質を使用せずに 500 マイクロリットルの TCM を新しいウェルに充填し、インサートをこれらの新しいウェルに移します。各インサートの使用済み収集ウェルから培地を別々のラベル付きチューブに収集し、チューブを氷の上に置きます。時点の間にTranswellプレートをインキュベーターに戻します。

各インサートについて、異なる時点から収集した培地を組み合わせ、短時間ボルテックスします。トラック希釈法を使用して収集した培地をLBオーガープレートにプレートし、実験の最初の2時間の細菌トランスサイトースの数を定量化します。4時間と6時間でメディアを収集します。

さらに、6時間後に、コントロールウェルから培地をプレートします。6時間で、TEERを測定して記録します。一晩インキュベートした後、トラック希釈LBプレート上で細菌コロニーを手動でカウントします。